牙本质基质蛋白1(DMP1)在小鼠颌下腺中的表达和定位

论文摘要

牙本质基质蛋白1（dental matrix protein 1,DMP1）被证明是一种酸性非胶原蛋白,系SIBLING蛋白家族成员之一。DMP1已被证实在牙和骨等矿化组织基质的形成和矿化过程中扮演着重要的角色。除了矿化组织,DMP1也被证实可以表达在大脑、胰腺、肾脏和唾液腺等非矿化组织中。颌下腺是小鼠唾液腺中最大的一对,由颌下腺分泌的唾液约占小鼠分泌总唾液量的70%。另外,在小鼠颌下腺中存在一类特殊的导管——颗粒曲状导管（granular convoluted tubule,GCT）。GCT合成并分泌许多重要的生物活性多肽,受甲状腺激素和雄性激素等激素的调控下使雌雄性小鼠颌下腺GCT发育不同从而造成小鼠颌下腺出现性别二态性,以及在小鼠出生后二周才开始出现并发育。这三个特征使GCT成为小鼠颌下腺中最特别而又具有重要功能的一类导管。尽管DMP1已被证明在小鼠颌下腺中表达,但迄今为止尚不清楚DMP1在小鼠颌下腺中的表达特点以及DMP1的两个水解活化片段,即DMP1-N和DMP1-C在小鼠颌下腺的表达和分布定位特点。近年来,有研究表明,在一些腺体肿瘤中DMP1的表达明显增高。这说明DMP1除了在矿化组织中具有调控基质矿化的功能,可能还具有其他的功能。本研究通过运用反转录PCR、实时定量PCR、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质免疫印迹、免疫组化、原位杂交和β-galactosi dase（Lac Z）expression assay等实验探究DMP1在雌雄性小鼠颌下腺中的表达模式以及全长形式DMP1水解后的两个活化片段——DMP1-C和DMP1-N在小鼠颌下腺内的表达和分布定位。通过研究,DMP1在雌雄性小鼠颌下腺中均表达,但DMP1在小鼠颌下腺中表达的量明显低于DMP1在小鼠牙中的表达。DMP1并不以全长形式存在于小鼠颌下腺中,而是以DMP1蛋白水解后的片段形式表达于颌下腺,即DMP1-C和DMP1-N。在小鼠颌下腺中,DMP1-C的分子量约为46 k Da,不同于DMP1-C在牙和骨等矿化组织中57 k Da的分子量。同DMP1-N在矿化组织中的分子量相同,DMP1-N在小鼠颌下腺中的分子量也为37 k Da。DMP1-C分布定位于雌雄性小鼠颌下腺的腺泡细胞和导管上皮细胞的细胞核中,DMP1-N分布定位于小鼠颌下腺的导管细胞的细胞浆中,但不包括雄性小鼠的GCT导管。对比不同年龄雌雄性小鼠颌下腺中DMP1的相对含量,2周时DMP1在雌雄性小鼠颌下腺中的相对含量并无明显差异,4周和12周时DMP1在雌雄性小鼠颌下腺中的相对含量具有显著性差异,DMP1在雄性小鼠颌下腺中的相对含量明显高于雌性小鼠。综合实时定量PCR、免疫组化、原位杂交和β-galactosi dase（Lac Z）expression assay的实验数据,不同于既往的研究结论,即DMP1不表达于雄性小鼠颌下腺的GCT导管,我们发现DMP1可以以DMP1-C的形式分布定位于雄性小鼠的GCT导管上皮细胞的细胞核中。综合研究结果,DMP1除了在牙和骨等矿化组织中具有调控基质形成和矿化的功能,在小鼠非矿化组织中可能还具有调控其它基因转录、激活基质金属蛋白酶9以及和基质金属蛋白酶9结合形成复合体增加肿瘤细胞侵袭等功能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 DMP1的基因结构
• 1.2 DMP1的理化性质
• 1.3 DMP1的活化片段
• 1.4 DMP1的分布定位
• 1.5 DMP1的生物学功能
• 1.6 DMP1的表达调控
• 2 前言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验小鼠来源
• 3.2 小鼠颌下腺总RNA提取
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）
• 3.3.1 主要试剂
• 3.3.2 主要实验仪器
• 3.3.3 实验方法
• 3.4 Quantitative real time polymerase chain reaction（qRT-PCR）
• 3.4.1 主要试剂
• 3.4.2 主要仪器
• 3.4.3 实验方法
• 3.5 小鼠颌下腺酸性蛋白质提取与分离
• 3.5.1 主要试剂
• 3.5.2 主要仪器
• 3.5.3 实验方法
• 3.6 SDS-PAGE和Western immunoblotting
• 3.6.1 主要试剂
• 3.6.2 主要仪器
• 3.6.3 实验方法
• 3.7 免疫组化（immunohistochemistry,IHC）
• 3.7.1 主要试剂
• 3.7.2 主要仪器
• 3.7.3 实验方法
• 3.8 原位杂交（in situ hybridization,ISH）
• 3.8.1 主要试剂
• 3.8.2 主要仪器
• 3.8.3 实验方法
• 3.9 β-galactosidase（LacZ） expression assay
• 3.9.1 主要试剂
• 3.9.2 主要仪器
• 3.9.3 实验方法
• 4 结果
• 4.1 DMP1 mRNA在小鼠颌下腺内的表达
• 4.1.1 RT-PCR
• 4.1.2 qRT-PCR
• 4.2 DMP1在小鼠颌下腺中的表达
• 4.2.1 小鼠颌下腺内的酸性非胶原蛋白
• 4.2.2 DMP1-C和DMP1-N在小鼠颌下腺中的表达
• 4.3 DMP1-C和DMP1-N在小鼠颌下腺内的定位
• 4.3.1 DMP1-C在小鼠颌下腺内的定位
• 4.3.2 DMP1-N在小鼠颌下腺内的定位
• 4.4 DMP1在雄性小鼠颌下腺GCT中的定位
• 4.4.1 原位杂交
• 4.4.2 β-galactosidase（LacZ） expression assay
• 5 讨论
• 5.1 DMP1在小鼠颌下腺中的表达
• 5.2 DMP1在小鼠颌下腺中的存在形式
• 5.3 DMP1在小鼠颌下腺中的定位
• 5.4 DMP1在雄性小鼠颌下腺GCT中的表达
• 6 结论
• 7 致谢
• 8 参考文献
• 9 个人简历