病毒dsRNA与平菇生理关系初探

论文摘要

近年来,平菇病毒的研究越来越受到重视,感染病毒的平菇菌丝生长速度缓慢且子实体畸形。但也有报道称病毒的存在对平菇并没有影响。本研究也从平菇病毒入手,研究病毒在平菇生理中的作用。研究结果如下:(1 )平菇带毒菌株的获取从辉县栽培基地选择平菇子实体,挑选子实体正常的和畸形的。然后进行组织分离,切取黄豆粒大小的子实体块,接种在PDA培养基中,萌发长出菌丝后进行转接得到纯培养的平菇菌丝体。两种菌丝在平板上生长势没有差异。(2)利用dsRNA技术提取病毒dsRNA基因组称取液体培养的菌丝球3g,利用dsRNA技术提取病毒dsRNA基因组,用0.75%琼脂糖凝胶电泳进行检测,子实体正常和畸形的平菇中均含有病毒dsRNA。子实体正常的菌株含有5个片段,分别为8.2、2.6、2.4、2.1、1.1Kb,其中8.2Kb的条带为doublet。子实体畸形的菌株比正常菌株少一条2.4Kb的条带,其余条带均相同。结果表明健康的平菇子实体中也含有病毒dsRNA,且所含dsRNA多于畸形株。(3)对子实体正常的平菇菌株进行脱毒研究采用原生质体再生脱毒法,0.6mol/L甘露醇作渗透压稳定剂,浓度为1.6%的溶壁酶溶液,30℃酶解菌丝3h,获得具有再生活力的原生质体。原生质体再生得到20个再生子。用dsRNA技术提取dsRNA,电泳检测脱毒效果,挑选出7个含不同dsRNA条带的菌株。挑选的20个再生子中只有一个菌株病毒完全脱除,其余的均为不完全脱除株。20个再生子中,2.4Kb的条带均被脱除,说明2.4Kb的条带有可能是裸露的,没有衣壳蛋白的包被。而且由于2.4Kb的条带存在正常菇形的平菇中,而畸形菇中不含有,说明其对平菇子实体的正常形成可能是有利的。(4)对这8个菌株进行生长速度、栽培阶段生理生化特性研究以出发菌株为对照,对脱毒后的菌株进行生理生化酶活的比较及产量比较,发现原含dsRNA条带最多的出发菌株在菌丝生长速度、漆酶酶活、CMCase酶活、木聚糖酶酶活及产量上均优于其它脱毒后得到的菌株,且发现出发菌株有一定的抗冻性。相反,完全脱除dsRNA的菌株在菌丝生长速度、酶活活性及产量上并不处于优势,而且有些酶活还基本处于最低值。说明病毒在平菇中的作用并不是有害的,病毒的存在不是一定能使平菇子实体畸形,相反,它对平菇的生长有利。(5)单引物扩增法对2.4Kb的条带进行测序测序后,在NCBI上Blast后,结果显示没有与其同源的序列。说明2.4Kb的条带可能为新的病毒dsRNA基因组,也有可能是平菇中存在的裸露dsRNA。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 平菇
• 1.1.1 平菇的分类、生物学特性及其栽培史
• 1.1.2 平菇的营养价值
• 1.1.3 平菇的药用价值
• 1.1.4 平菇的经济价值
• 1.2 平菇畸形菇问题概述
• 1.3 食用菌病毒的研究现状
• 1.3.1 食用菌病毒的形状
• 1.3.2 食用菌病毒病的症状与危害
• 1.3.3 双孢菇病毒概况
• 1.3.4 香菇病毒
• 1.3.5 其它食用菌病毒
• 1.4 平菇病毒研究现状
• 1.4.1 真菌病毒的种类
• 1.4.2 平菇病毒的概述
• 1.4.3 平菇病毒基因组的提取
• 1.4.4 平菇脱毒技术概述
• 1.4.4.1 菌丝尖端脱毒和原基组织脱毒
• 1.4.4.2 原生质体再生脱毒技术
• 1.4.5 真菌与其所感染病毒的关系
• 1.4.6 病毒dsRNA 测序
• 1.5 平菇胞外酶研究现状
• 1.5.1 木聚糖酶
• 1.5.2 漆酶
• 1.5.3 纤维素酶系
• 2 引言
• 3 材料和方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 试验中主要溶液的配制
• 3.1.6 引物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 内转录间隔区（ITS）分析
• 3.2.2 dsRNA 的提取
• 3.2.3 dsRNA 的酶切验证
• 3.2.4 原生质体再生脱毒
• 3.2.5 脱毒菌株菌丝生长速度测量
• 3.2.6 脱毒菌株栽培阶段生理生化特性研究
• 3.2.6.1 粗酶液的制备
• 3.2.6.2 纤维素酶活性的测定
• 3.2.6.3 木聚糖酶活性的测定
• 3.2.6.4 漆酶活性的测定
• 3.2.7 目的条带的回收
• 3.2.8 2.6Kb 条带的片段扩增
• 3.2.9 单引物扩增法
• 3.2.10 PCR 产物与T 载体的酶连反应
• 2 法）'>3.2.11 感受态细胞的制备方法（CaC1₂法）
• 3.2.12 转化
• 3.2.13 转化子筛选
• 3.2.14 质粒提取
• 3.2.15 送样测序
• 4 结果与分析
• 4.1 平菇带毒菌株的获得
• 4.1.1 两个菌株初次分离及平板菌丝生长情况
• 4.1.2 畸形菇的ITS 序列比对结果
• 4.1.3 分离的两个菌株中含dsRNA 的情况
• 4.1.4 对菇形正常的菌株进行DNase 酶切验证
• 4.1.5 小结
• 4.2 带毒菌株的脱毒研究及比较
• 4.2.1 出发菌株经原生质体脱毒后所得到的含dsRNA 不同的菌株
• 4.2.2 菌丝在栽培种上的生长速度
• 4.2.3 胞外酶酶活的变化情况
• 4.2.3.1 漆酶酶活变化情况
• 4.2.3.2 羧甲基纤维素酶酶活变化情况
• 4.2.3.3 木聚糖酶酶活变化情况
• 4.2.4 对各菌株三种酶活做1%极显著水平差异分析
• 4.2.5 前两茬菇的总产量
• 4.2.6 小结
• 4.3 平菇病毒基因组部分条带测序
• 4.3.1 2.6Kb 条带的部分片段电泳图
• 4.3.2 单引物测序法从2.4Kb 左右的条带中得到的条带
• 4.3.3 测得730Kb 的序列
• 4.3.4 小结
• 5 主要结论、讨论及对后续研究工作的设想
• 5.1 主要结论
• 5.2 讨论
• 5.3 后续工作设想
• 参考文献
• ABSTRACT