柑橘采后生防菌34-9抗真菌活性物质的研究

论文摘要

柑橘采后因真菌性病害造成的损失严重,其中以青霉（Penicillium italicum）和绿霉（Penicillium digitatum）为主。虽然国内外已筛选出了多株柑橘采后生防菌,但能够开发应用的较少。其原因多是由于生防菌单独使用难以达到化学杀菌剂的效果,或活菌制剂的发酵工艺不够完善。这就迫切地需要对生防菌的拮抗机理进行研究,以针对性的提高其抑菌活性或改良其生物学特性。本研究旨在明确Kloeckera apiculata（34-9）产生活性抑菌物质的拮抗机理。对拮抗物质进行提取分离,检测其抑菌谱和生理生化性质;摸索其纯化条件和发酵条件;由离体、活体实验确定其抑菌作用的有效性,主要结果如下:1.确定了活性物质的提取方法。以不同饱和度的（NH4）2SO4沉淀不能分离出抑菌成分;采用乙醚浸提或萃取可分别从抑菌区域、无菌发酵液中分离出抑菌活性物质;经20s×4的微波处理可有效破碎酵母细胞,破碎液经乙醚萃取也可获得抑菌物质。2.对粗提取物的生理生化性质研究结果表明:粗提物对柑橘、葡萄、芒果的主要采后病害均有一定抑制作用;经121℃高温高压处理20min、胰蛋白酶、蛋白酶K处理,都不能破坏其活性;4℃下保存一个月,仍能维持较强的抑菌作用。在酵母菌对数生长中期就可检测到抑菌物质,对数生长末期达到较高值,稳定期后,其产量无显著变化。经显色反应表明,粗提取物呈酸性,其中含有酚类和黄酮类的特征基团;确定了苯:乙醚（5:5）为TLC展开的最佳条件,并在Rf值为0.78处回收获得了经纯化的活性组分;在45%的甲醇-水洗脱下,经HPLC全波长检测,证明了回收组分的纯度。3.发酵条件优化结果表明:在自然pH值条件下,接种量为1%,250ml的摇瓶中装液量为50ml,培养24h时,活性物质的产量较大。离体条件下,10倍稀释的粗提物可完全抑制柑橘青霉（P.italicum）病原孢子萌发;活体果实实验表明,粗提物水溶液可显著抑制柑橘绿霉（P.digitatum）,处理4d后,防腐率达96%以上,6d后,粗提物的防腐作用显著高于发酵液。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 采后真菌性病害概述
• 1.1.1 果品生产及采后损失状况
• 1.1.2 采后真菌病害的发生
• 1.2 柑橘主要采后病害及其防治方法
• 1.2.1 柑橘主要采后病害
• 1.2.2 病害控制技术研究
• 1.3 生防酵母菌的拮抗机理
• 1.3.1 营养、空间竞争
• 1.3.2 诱导寄主抗性
• 1.3.3 直接寄生作用
• 1.3.4 分泌拮抗物质
• 1.4 微生物产拮抗物质研究进展
• 1.4.1 细菌产拮抗物质的研究
• 1.4.2 放线菌产拮抗物质的研究
• 1.4.3 真菌产拮抗物质的研究
• 1.5 课题来源及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 酵母菌
• 2.1.2 病原菌
• 2.1.3 供试果实
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 活性成分的分离
• 2.2.1.1 抑菌圈内活性物质分离
• 2.2.1.2 无菌发酵液中活性物质分离
• 2.2.1.3 细胞内活性物质分离
• 2.2.1.4 胞内外活性物质分离
• 2.2.2 活性成分生理生化特性研究
• 2.2.2.1 抑菌谱检测
• 2.2.2.2 热稳定性检测
• 2.2.2.3 蛋白酶耐受性检测
• 2.2.2.4 酸碱耐受性检测
• 2.2.2.5 溶解性检测
• 2.2.2.6 活性成分产生与生物量及pH值的关系
• 2.2.2.7 发酵液及其活性成分稳定性
• 2.2.3 活性成分定性分析
• 2.2.4 活性成分初步纯化
• 2.2.4.1 系统溶剂萃取
• 2.2.4.2 微量圆环展开
• 2.2.4.3 TLC展开
• 2.2.4.4 HPLC分离检测
• 2.2.5 产生活性成分发酵条件优化
• 2.2.5.1 接种量
• 2.2.5.2 初始pH值
• 2.2.5.3 装液量
• 2.2.5.4 培养时间
• 2.2.6 活性成分抑菌实验
• 2.2.6.1 抑制孢子萌发
• 2.2.6.2 活体实验
• 3 结果与分析
• 3.1 活性成分的分离
• 3.1.1 抑菌圈内活性物质分离
• 3.1.2 无菌发酵液中活性物质分离
• 3.1.3 细胞内活性物质分离
• 3.2 活性成分生理生化特性研究
• 3.2.1 抑菌谱检测
• 3.2.2 热稳定性检测
• 3.2.3 蛋白酶耐受性检测
• 3.2.4 酸碱耐受性检测
• 3.2.5 溶解性检测
• 3.2.6 活性成分产生与生物量及pH值的关系
• 3.2.7 发酵液及其活性成分稳定性
• 3.3 活性成分定性分析
• 3.4 活性成分初步纯化
• 3.4.1 系统溶剂萃取
• 3.4.2 微量圆环展开
• 3.4.3 TLC展开
• 3.4.4 HPLC分离检测
• 3.5 产生活性成分发酵条件优化
• 3.5.1 接种量
• 3.5.2 初始pH值
• 3.5.3 装液量
• 3.5.4 培养时间
• 3.6 活性成分抑菌实验
• 3.6.1 抑制孢子萌发
• 3.6.2 活体实验
• 4 讨论
• 4.1 酵母菌细胞破碎
• 4.2 酵母菌产生的活性物质
• 4.3 未知活性物质的分离
• 4.3.1 系统溶剂法
• 4.3.2 薄层层析
• 4.4 未知活性物质的定性分析
• 4.4.1 显色反应
• 4.4.2 高效液相色谱
• 下一步研究计划
• 参考文献
• 致谢
• 附图及说明