稳定表达猪CD163的PAM细胞系的建立

论文摘要

CD163是SRCR蛋白超家族的一员,为典型的Ⅰ型糖基化膜蛋白,因富含半胱氨酸,内部可以形成的9个由二硫键连接的构成的结构域。研究表明CD163与PRRSV感染密切相关,其作为PRRSV的受体介导病毒的脱衣壳和病毒核酸在细胞质内的释放。猪肺泡巨噬细胞（PAM）为PRRSV的靶细胞,目前通过SV40Large T抗原转染原代PAM细胞构建了3个传代细胞系,但均不支持PRRSV感染,检测发现细胞系无CD163表达。本研究旨在通过含CD163基因的重组真核表达质粒转染传代PAM细胞系,使其表达CD163,以期获得能够支持PRRSV感染的细胞系。1.CD163基因全长克隆获得及重组真核表达载体构建与鉴定根据GenBank上发表的猪CD163基因序列设计并合成了扩增猪CD163开放阅读框序列的特异性引物。由实验室保存原代猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出3348bp的目的片段,并将其克隆到pMD19-T载体,经PCR,酶切和测序证明为猪CD163序列。鉴于扩增过程中CD163cDNA中有5个位点的碱基突变引起相应的氨基酸的改变,使用TaKaRa公司的点突变试剂盒将所涉及的碱基加以突变修饰。将基因片段克隆到真核表达质粒pcDNA4.0和pIRES载体上,通过酶切鉴定确定重组真核表达质粒构建成功。2.猪CD163的PRRSV受体的功能本实验旨在通过重组真核表达质粒pIRES-CD163瞬时转染PRRSV的非敏感细胞系BHK-21和PK-15,利用RT-PCR方法和间接免疫荧光技术检测CD163在细胞上的表达,然后进行病毒增殖试验,对比转染CD163前后细胞对PRRSV敏感性的变化。以验证猪CD163作为PRRSV受体,仅表达CD163就能够使得非敏感细胞系对PRRSV敏感的论断。瞬时转染pIRES-CD163后的BHK-21和PK-15细胞中均表达了CD163,并且这些转染后的细胞能够增殖PRRSV并产生子代病毒。3.稳定表达CD163的PAM细胞系的建立本实验旨在使用重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163瞬时转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21（CRL-2843）,经RT-PCR方法和间接免疫荧光技术确定CD163在细胞上的表达后,添加zeocin进行抗性筛选,采用有限稀释法,经过3轮筛选获得8株阳性克隆,分别命名为3G10-C2,3G10-D2,3G10-F2,3G10-B3,3G10-D4,3G10-B6,3G10-A8,3G10-H8。该8个阳性克隆阳性率均在90%以上。使用RT-PCR、间接免疫荧光技术检测确定重组PAM细胞系构建成功。重组PAM细胞系进行PRRSV增殖实验,确定转染CD163后细胞对PRRSV增殖能力。去除抗生素后连续传代10代,间接免疫荧光检测确定重组细胞株在10代内性状稳定。本实验稳定表达猪CD163的PAM重组细胞系,主要目的在于利用该重组细胞系体外繁殖PRRSV,并且使用重组PAM细胞株进行中和抗体实验,对不同的PRRSV疫苗进行质量评价

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征受体CD163研究进展
• 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述
• 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体的研究进展
• 2.1 病毒受体概述
• 2.2 病毒侵入宿主细胞的过程
• 2.3 与PRRSV感染相关细胞受体研究
• 3 CD163蛋白结构
• 4 预测SRCR 5结构域中与PRRSV结合相关的结构
• 5 CD163的表达与调节
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 第二章 CD163基因克隆及重组真核表达载体构建与鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因的RT-PCR扩增
• 2.2 重组质粒pMD19-T-CD163的琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 2.3 CD163基因测序及分析
• 2.4 重组质粒pcDNA4.0-CD163的酶切鉴定
• 2.5 重组质粒pIRES-CD163的酶切鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 猪CD163的PRRSV受体的功能
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组真核表达质粒pIRES-CD163的大量提取及鉴定
• 2.2 BHK-21细胞和PK-15细胞瞬时转染重组真核表达质粒pIRES-CD163后间接免疫荧光检测
• 2.3 RT-PCR检测mRNA水平CD163表达
• 2.4 细胞对PRRSV增殖能力检测
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第四章 稳定表达CD163的PAM细胞系的建立
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163大提酶切鉴定
• 2.2 重组真核表达质粒pCDNA4.0-CD163转染PAM细胞
• 2.3 RT-PCR检测重组细胞株中CD163的表达
• 2.4 通过间接免疫荧光的方法对CD163在PAM细胞表面的表达进行定位
• 2.5 表达CD163的PAM细胞系传代稳定性的鉴定
• 2.6 稳定表达CD163的PAM细胞对病毒增殖能力检测
• 2.7 重组PAM细胞株接毒后细胞病变
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 致谢