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Gr-1+/CD11b+细胞通过PD-L1调节实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究和EAE对神经发生影响的初步探讨

2020-12-07阅读(349)

Gr-1+/CD11b+细胞通过PD-L1调节实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究和EAE对神经发生影响的初步探讨

论文摘要

研究背景1.多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）作为一种具有复杂临床、遗传及病理学背景的中枢神经系统（central nervous system, CNS）自身免疫疾病,其发病受到诸多因素的影响,并有多种内源性调节因子和途径参与其中。Gr-1+/CD11b+细胞作为一群具有免疫抑制功能的髓样细胞,在多种疾病中均显著增多,参与调节疾病的进展及严重程度,但在MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmne encephalo- myelitis, EAE ）中对该群细胞的研究却鲜有报道。PD-L1/PD-1（programmed cell death ligand-1/programmed death-1）是B7/CD28共刺激分子超家族的重要成员,其信号通路在EAE中发挥的免疫抑制作用已得到广泛认可。但是该疾病中的Gr-1+/CD11b+细胞能否通过表达PD-L1来发挥其免疫调节作用,仍有待研究。2.从啮齿类动物到人类的成年大脑都具有产生新神经元的能力,这为治疗诸多疾病产生的CNS损害提供了可能。现已证实,多能的神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cell, NSC/NPC）主要产生于大脑内的两个区域,分别为海马齿状回（dentate gyrus, DG）的颗粒下区（subgranular zone, SGZ）以及侧脑室下区（subventricular zone, SVZ）。虽然迄今已有多项研究探讨了EAE动物的神经发生,但研究结论却存在矛盾,且这些研究都主要关注SVZ区,而未涉及DG区,上述矛盾和尚未解决的问题有待进一步确认。目的1.观察Gr-1+/CD11b+髓样细胞在MOG35-55诱导的EAE小鼠模型中的数量变化以及PD-L1在该群细胞上的表达情况;明确Gr-1+/CD11b+细胞是否对体外T细胞的增殖有抑制作用以及PD-L1分子在其中的贡献。2.借助MOG诱导的慢性持续型EAE模型,探讨EAE对成年神经发生的影响,重点关注DG区和SVZ区NSC/NPC增殖能力的变化。方法1.用MOG35-55肽段免疫诱导C57BL/6雌性小鼠建立EAE模型,用苏木精-伊红（hematoxylin & eosin, HE）染色和劳克坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）髓鞘染色确定发病小鼠CNS的组织病理学改变;借助免疫荧光染色方法和流式细胞检测分析确定EAE动物脾脏及CNS是否存在Gr-1+/ CD11b+髓样细胞并检测其数量变化,继而检测该群细胞表面PD-L1分子的表达情况;用体外细胞共同培养的方法探讨Gr-1+/CD11b+细胞对CD4+和CD8+ T细胞增殖的抑制作用,并确定PD-L1在其中的贡献。2.借助MOG35-55肽段诱导建立慢性持续型EAE模型,在BrdU掺入和免疫荧光染色基础上,借助BrdU+细胞数量变化来衡量EAE动物大脑海马齿状回SGZ区和SVZ区NSC/ NPC的增殖能力。结果1.MOG35-55肽段免疫后,C57BL/6小鼠出现了不同程度的肢体瘫痪症状,EAE发病率为80 %。HE染色显示在患病小鼠的CNS中有大量的炎症细胞浸润,LFB染色显示在炎性浸润病灶内可见多个髓鞘脱失区;而对照组动物始终未出现任何的神经系统症状,CNS中也未见任何病理学改变的征象。在EAE组动物CNS组织中可见很多Gr-1+/CD11b+细胞,而在对照组未发现任何的阳性细胞。与对照组相比,EAE组动物的脾脏明显增大（146.5±12.4 mg vs. 67.2±8.7 mg,P < 0.001）,流式细胞检测结果显示,EAE动物脾脏中的Gr-1+/CD11b+细胞数量明显增多,与对照组相比有显著性差异;与免疫荧光染色的结果一致,在EAE动物的CNS中亦可见增加的Gr-1+/CD11b+细胞,而对照组却未见任何阳性细胞。进一步的研究证实,EAE动物Gr-1+/CD11b+细胞表面的PD-L1表达上调。体外功能实验显示,该群细胞可明显抑制CD4+和CD8+ T细胞的分裂增殖,而加入抗体阻断PD-L1后这种抑制作用会有不同程度的缓解。2.MOG诱导C57BL/6小鼠发生慢性持续型EAE,这些动物在疾病达到高峰后症状会有短暂缓解,随后进入一个较稳定的慢性持续期;而对照组动物始终未出现任何临床症状。脑组织的双重免疫荧光染色结果显示,在EAE动物大脑海马齿状回SGZ区未发现正在增殖的CD4+ T细胞（BrdU+/CD4+）;但在SVZ区分布有个别的BrdU+/CD4+ T细胞,尽管这些细胞在该区所有BrdU+细胞中所占的比例仅为0.3 %,不会对BrdU+细胞计数的最终结果产生不利影响。统计结果显示,EAE组小鼠海马齿状回SGZ区的BrdU+细胞数量显著低于对照组（降低15.7±4.0 %[Mean±SEM],P < 0.05）;与之相似,EAE组动物大脑SVZ区的BrdU+细胞数量亦显著降低（降低10.0±2.9 %,P < 0.05）,提示此时NSC/NPC的增殖能力受损。结论1.EAE导致动物脾脏和CNS组织中Gr-1+/CD11b+髓样细胞的数量显著增多,且该群细胞表面的PD-L1表达上调;Gr-1+/CD11b+髓样细胞可通过PD-L1信号途径抑制体外T细胞的增殖,这为EAE疾病的免疫调节提供了新的途径。2.慢性持续型EAE可导致动物大脑海马齿状回SGZ区和SVZ区的NSC/ NPC增殖能力下降,而海马区神经发生的降低可能会为慢性MS患者普遍存在的认知功能损害作出部分解释。

论文目录

  • 缩略语表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 文献回顾
  • 正文
  • 实验一 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立与评价
  • 0 引言
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物及分组
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 小鼠EAE 模型的诱导
  • 2.2 组织取材和冰冻切片
  • 2.3 组织HE 染色
  • 2.4 组织LFB 髓鞘染色
  • 3 结果
  • 3.1 EAE 症状评分及发病率
  • 3.2 神经组织病理学改变
  • 4 讨论
  • +/CD11b+细胞在 EAE 中的变化及在 CNS 病灶中存在的形态学证据'>实验二 Gr-1+/CD11b+细胞在 EAE 中的变化及在 CNS 病灶中存在的形态学证据
  • 0 引言
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物及分组
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 小鼠EAE 模型的诱导
  • 2.2 组织取材和冰冻切片
  • 2.3 免疫荧光染色
  • 2.4 脾脏及CNS 中淋巴细胞的提取
  • +/CD11b+细胞'>2.5 流式细胞检测Gr-1+/CD11b+细胞
  • 3 结果
  • 3.1 免疫荧光染色结果
  • 3.2 流式细胞检测结果
  • 4 讨论
  • +/CD11b+细胞中的表达及对体外 T细胞增殖的影响'>实验三 PD-L1 分子在EAE 动物Gr-1+/CD11b+细胞中的表达及对体外 T细胞增殖的影响
  • 0 引言
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物及分组
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 小鼠EAE 模型的诱导
  • 2.2 组织取材及免疫荧光染色
  • +细胞的PD-L1 表达'>2.3 流式细胞检测脾脏Gr-1+/CD11b+细胞的PD-L1 表达
  • 2.4 正常小鼠脾脏CD4+和CD8+ T 细胞的提纯
  • +细胞的提纯'>2.5 EAE 小鼠CNS 中Gr-1+/CD11b+细胞的提纯
  • 2.6 体外T 细胞增殖实验
  • 3 结果
  • 3.1 免疫荧光染色结果
  • 3.2 流式细胞检测结果
  • +细胞抑制体外T 细胞增殖'>3.3 Gr-1+/CD11b+细胞抑制体外T 细胞增殖
  • 4 讨论
  • 实验四 慢性持续型EAE 对神经干/祖细胞增殖变化影响的初步探讨
  • 0 引言
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物及分组
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 小鼠EAE 模型的诱导及评价
  • 2.2 组织取材和冰冻切片
  • 2.3 双重免疫荧光染色
  • 2.4 BrdU 免疫荧光染色
  • 2.5 阳性细胞显微分析及计数
  • 2.6 统计学处理
  • 3 结果
  • 3.1 慢性持续型EAE 小鼠模型的建立及评价
  • 3.2 慢性持续型EAE 导致NSC/NPC 增殖能力受损
  • 4 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 个人简历和研究成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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