4种人源SUMO-tag原核融合表达系统的建立

论文摘要

基因表达技术可以为生命科学研究和医药生产带来大量的活性蛋白,这种技术包括原核表达系统和真核表达系统。其中以原核表达系统因为操作方便,成本低廉而最为常用。针对原核表达系统难以纯化和易生成包涵体的缺点,科学家又设计出融合表达系统。在这些融合表达系统中,SUMO融合表达系统依靠其高促溶表达和易于精确切割而成为众人瞩目的新星。我们尝试从4种人源SUMO蛋白中,寻找具有最高促表达和促溶效果的成员做为融合标签来建立原核融合表达系统。本研究中以4种人源SUMO蛋白作为融合标签,以PET28a作为载体骨架,构建4种融合表达载体——pS1,pS2,pS3,pS4,然后以P53蛋白和GFP蛋白作为融合目的蛋白分别插入到这4种SUMO-tag的表达载体和PET28a载体中,得到10种融合表达载体（ pS1-P53, pS2-P53, pS3-P53, pS4-P53, pS1-GFP, pS2-GFP, pS3-GFP, pS4-GFP,p28-P53,p28-GFP ） ,把这些融合载体转入表达菌株——BL21-CodonPlus（DE3）-RIL。诱导融合蛋白表达,比较当4种SUMO-tag促表达和促溶效果的高低。我们又利用PET28a质粒构建SUMO蛋白酶SENP1的C端活性序列的原核表达载体——pSENP1C,进行诱导表达,纯化产物。同时诱导表达GST-SUMO1-SUMO1蛋白,纯化产物后作为底物与SENP1C进行酶促反应,检测SUMO蛋白酶的活性。研究发现,以SUMO1作为融合标签时,对于P53和GFP两种重组蛋白的促表达和促溶效果是最好的。我们诱导表达的SENP1C具有较好的可溶性。纯化后与底物GST-SUMO1-SUMO1蛋白反应,有切割的GST-SUMO1条带出现,说明SENP1C具有活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 蛋白质表达技术（Protein expression techniques）
• 1.1.1 概念
• 1.1.2 原核表达系统
• 1.2 融合表达系统
• 1.2.1 概念
• 1.2.2 融合标签种类
• 1.2.3 融合标签的切除
• 1.3 SUMO 融合表达系统
• 1.3.1 SUMO
• 1.3.2 SUMO 蛋白酶
• 1.3.3 SUMO 融合系统
• 1.4 本研究的目的和思路
• 1.4.1 目的
• 1.4.2 思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试剂和实验材料
• 2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 构建4 种SUMO-tag 表达载体，诱导蛋白表达和检测
• 2.3.2 P53 和GFP 的SUMO-tag 融合表达载体的构建
• 2.3.3 SUMO-P53 融合蛋白和SUMO-GFP 融合蛋白可溶性比较
• 2.3.4 SENP1 C 端序列的表达、纯化和活性鉴定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 PS1，PS2，PS3，PS4 的构建和鉴定，以及蛋白诱导表达
• 3.2 构建融合P53 和GFP 的SUMO-tag 融合表达载体，进行鉴定
• 3.3 P53 和GFP 融合表达载体蛋白诱导表达的表达量和可溶性比较
• 3.4 PSENP1C 载体的构建，表达，纯化及酶活鉴定
• 3.5 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介