一、JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究 二、dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究

论文摘要

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤。近年来,全球膀胱癌发病率呈上升趋势,尤其在中国,其上升趋势更为明显。膀胱癌形成是一个多因素和多阶段的过程,是环境危险因素和遗传因素共同作用的结果。流行病学调查显示,环境危险因素的暴露在膀胱癌发病中具有重要的作用。尽管很多人接触相同的致癌危险因素,但仅有少数人最终发生膀胱癌,提示人群中存在肿瘤易感性。国内外大量研究发现肿瘤易感性可能和多种基因多态性相关。JWA（GenBank:AF070523,1998）是周建伟等从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离并克隆的,受ATRA诱导的新的细胞骨架样基因。本课题组多年来一直围绕JWA基因的结构、功能及其相互关系开展研究工作,取得了一系列原创性有意义的研究成果。先后证实JWA是一种新的微管相关蛋白（microtubule-associated protein,MAP）,不仅参与全反式维甲酸（ATRA）诱导的细胞分化调节,而且与多种细胞分化、凋亡诱导剂（如TPA,4HPR和As2O3等）的生物学作用有关,涉及相应的信号通路,而且活跃地参与细胞对应激刺激（如冷应激和热应激）的应答。Ingley等发现了第一个与JWA同源的基因ARL-6（AF133912）。两者氨基酸序列同源性达93%,而该基因的作用主要涉及PARP与DNA损伤和修复。本课题组最近的研究表明细胞内JWA的表达对于其抵抗氧化应激造成的DNA损伤有一定的保护作用,并且JWA是XRCC1和PARP1的上游调节因子,可能参与氧化应激诱导的碱基切除修复过程,其功能与调节细胞内XRCC1-PARP1信号通路有关;另外,JWA参与了MAPK信号通路,与细胞的迁移和运动有关,而细胞迁移是恶性肿瘤细胞浸润和转移的必要条件。这些结果强烈提示JWA可能是参与调节肿瘤细胞分化的重要信号分子,是一个潜在的抑癌基因。本研究主要用PCR-SSCP方法鉴定了JWA基因的四个多态性位点,并在膀胱癌病例-对照研究中分析JWA基因多态性与膀胱癌危险性的关系,以及JWA基因在膀胱和膀胱癌组织中的表达水平。初步探讨了JWA-76G＞C变异可能影响的转录因子,为最终阐明和完善JWA基因作为潜在的抑癌基因这一假设提供新的证据。一、JWA基因多态性位点的鉴定及-76G＞C变异的功能分析本研究在100名正常的中国汉族人群中,用PCR-SSCP方法筛选、鉴定JWA基因的多态性位点。结果证实了两个SNPs（723T＞G,rs7038and 454C＞A,rs10489）并且发现了另外两个新的SNPs（-76G＞C and380G＞A）。报告基因结果显示,变异的-76C等位基因型报告基因在不处理或B（a）P处理后,与-76G等位基因型的报告基因相比,其转录活性分别下降了4倍或12倍多。为了证明JWA基因是否在翻译水平应答B（a）P,我们用Western blot方法检测了B（a）P处理前后NIH-3T3细胞中JWA表达水平。结果发现B（a）P暴露能显著诱导JWA蛋白表达增加。这些结果提示-76C变异使得JWA对B（a）P引起的活性氧刺激不应答。我们还在不同种族人群中检测了-76G＞C多态性位点的基因型和等位基因分布频率,发现该位点基因型和等位基因频率有种族差异。二、JWA多态性与膀胱癌危险性的关系在膀胱癌病例-对照研究中,我们发现-76G＞C变异和454C＞A变异都能显著增加膀胱癌危险陛,而723T＞G变异则与膀胱癌危险性降低有关。连锁不平衡分析显示-76G＞C和454C＞A两个多态性位点是连锁不平衡的,在做单倍体型分析后,发现随着变异等位基因数的增加,膀胱癌危险性也随着显著增加。进一步分层分析结果显示,膀胱癌发生危险性在高年龄组、吸烟人群组和饮酒人群组都更加明显。鉴于-76G＞C变异有一定的功能作用,能影响JWA基因对氧化应激的应答水平,我们检测了该多态性位点与吸烟╱饮酒之间有无基因-环境交互作用;结果提示携带-76GC基因型的吸烟者或饮酒者膀胱癌危险性显著增加,然而,在基因-环境交互作用的分析中,我们未发现它们之间作用有统计学意义的证据,这可能受到本研究效率的限制。为了检测-76G＞C变异是否会影响组织中JWA的蛋白表达水平,我们运用免疫组化方法在JWA-76G＞C不同基因型的膀胱组织或膀胱癌组织中检测JWA蛋白的表达水平,结果发现-76GG基因型的组织JWA蛋白水平明显高于-76GC基因型的组织。这些结果提示JWA作为一个潜在的抑癌基因,其多态性位点与膀胱癌易感性有密切联系。三、初步鉴定JWA-76G＞C变异影响的转录因子我们首先用Alibaba 2软件对-76G＞C多态性位点所在的DNA序列进行转录因子结合基序预测,结果提示76G＞C变异可能使的原C/EBPα结合位点变成了C/EBPβ结合位点,进一步采用胶泳动率迁移实验（EMSA）证实,在H2O2和B（a）P处理组,均发现有核蛋白和-76GG探针结合。用Southwestern实验证实,此核蛋白的分子量为43 kD左右。初步确认JWA-76GΚC变异影响的转录因子为C/EBPα。四、构建JWA -76GC或-76CC基因型的正常细胞株为了进一步探讨JWA基因-76GΚC多态性变异在细胞中的作用,我们拟构建JWA -76CC或-76GC基因型的正常细胞株。经过多次改进实验技术和更换细胞株后,我们仍未能获得-76CC或-76GC基因型的正常细胞株。综上所述,本研究鉴定了JWA基因四个多态性位点:-76G＞C,380G＞A,454C＞A和723T＞G;对-76G＞C多态性的功能研究中发现,-76C变异能显著性降低JWA基因对氧化应激的应答,其机制可能是影响了核因子C/EBPα与JWA基因启动子的结合能力。在膀胱癌病例对照研究中发现,-76G＞C变异和454C＞A变异都能显著增加膀胱癌危险性,而723T＞G变异则与膀胱癌危险性降低有关。-76G＞C变异可引起膀胱癌组织中JWA蛋白水平降低。另外,由于种种原因,我们构建JWA -76GC或-76CC基因型的细胞株实验未能获得成功。酒精滥用已经是一个严重的公共卫生问题,不断的摄入酒精可导致酒精耐受,随后产生依赖性,最后成瘾。然而,酒精耐受和成瘾的机制还没有完全清楚。果蝇已经成为研究酒精耐受分子机制的常用动物模型。JWA,一个新的微管结合蛋白,参与调节细胞应激、细胞内氨基酸转运等。有研究提示该基因可能参与吗啡耐受和依赖的形成。本研究探讨了JWA是否参与果蝇酒精耐受的机制。我们首先确认了果蝇基因组的JWA同源基因,CG10373（dJWA）;然后用显微注射法构建了anti-dJWA和cDNA-dJWA果蝇种系。用RT-PCR和Real-time PCR方法检测了dJWA在不同果蝇种系的表达水平。最后用酒精蒸汽暴露装置检测了dJWA对果蝇酒精暴露产生急性耐受的影响。JWA基因结构上保守,人源性的JWA与果蝇dJWA有41.4%的氨基酸同源和53.6%的DNA序列同源。RT-PCR和Real-time PCR结果显示anti-dJWA和cDNA-dJWA果蝇种系构建成功。在果蝇醉酒实验中我们发现,w1118果蝇和cDNA-dJWA果蝇暴露于酒精蒸汽2次后就产生了酒精耐受现象,但是anti-dJWA果蝇却没有出现酒精耐受现象。同样,我们在果蝇酒精镇静复苏实验中也发现了anti-dJWA果蝇酒精耐受现象消失了,并且比其他两种果蝇对酒精更加敏感（第二次暴露后约有20%的果蝇死亡）。另外,我们发现酒精暴露前后乙醇脱氢（ADH）基因的mRNA水平没有显著性差异,而果蝇中dJWA低表达时,hangover基因的转录水平也下调了。综上所述,我们的结果提示果蝇的dJWA基因在酒精耐受过程中起重要作用。低表达dJWA的果蝇经过多次暴露于酒精蒸汽不能产生酒精耐受现象。结合先前的研究结果,我们认为JWA可能是酒精耐受和药物成瘾发生机制中的一个非常重要的功能性分子机制。本研究的结果为酒精耐受和成瘾相关的研究提供了新的思路。

论文目录

• 缩略语
• 第一部分 JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 分析与讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 分析与讨论
• 参考文献
• 附录:相关论文
• 致谢
• 综述