鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗研制及其免疫应答反应的动态研究

论文摘要

本研究选取鸭致病性大肠杆菌（E.coli）常见血清型O1,O2,O18,O78和三株分离自发病鸭场,毒力强、免疫原性好的巴氏杆菌（P.M）D22,D23,D157作为制苗菌株,分别以5%血琼脂培养基和马丁琼脂培养基进行固体表面培养制备抗原,与蜂胶佐剂高速乳化,制备鸭源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗。通过对供试鸭的攻毒保护试验、用ELISA方法对供试鸭特异性抗体消长规律的研究以及用MTT法对供试鸭外周血T淋巴细胞免疫水平的检测三个方面对此疫苗的安全性、免疫原性进行了研究。安全性检验及最佳免疫剂量筛选结果表明,疫苗安全可靠,疫苗最佳免疫剂量为4.2×109CFU/mL,0.5mL（E.coli约84亿CFU,P.M约63亿CFU）,在4℃可保存12个月。攻毒保护试验结果表明,雏鸭首免后第14d时,一次免疫组对E.coli、P.M的攻毒保护率分别为100%、90%,二免后第14d时,二次免疫组可产生坚强免疫力,攻毒保护率均为100%。本研究采用鸭巴氏杆菌、大肠杆菌全菌裂解抗原为包被抗原,建立检测P.M-E.coli灭活疫苗免疫后的鸭血清中特异性抗体的ELISA方法。确定了巴氏杆菌抗原最佳包被浓度:D22:11μg/mL,D23:17μg/mL,D157:16μg/mL,混合裂解抗原:14.7μg/mL,HRP-羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.25μg/mL;大肠杆菌抗原最佳包被浓度:O1:18.86μg/mL,O2:16.76μg/mL,O18:17.43μg/mL,O78:16.32μg/mL,混合裂解抗原:20μg/mL,HRP-羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.5μg/mL。免疫鸭抗体消长规律检测结果表明,雏鸭免疫3d后,免疫组四个血清型E.coli抗体水平均极显著（P＜0.01）高于空白对照组,二次免疫组抗体水平显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于一次免疫组,首免后20d左右抗体水平达到高峰,然后逐渐下降,到第54d时抗体水平仍显著高于首免后第9d相应组抗体水平,与第13d抗体水平相当;免疫组三株P.M抗体水平均极显著（P＜0.01）高于空白对照组,二次免疫组抗体水平显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于一次免疫组,首免后20d左右抗体水平达到高峰,然后逐渐下降,到第54d时抗体水平仍高于首免后第13d相应组抗体水平或相当。T淋巴细胞转化试验结果表明,E.coli-P.M二联蜂胶疫苗免疫雏鸭外周血淋巴细胞转化水平在首免后极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于对照组,二次免疫组的细胞免疫水平比一次免疫组高,维持时间在3周左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 鸭大肠杆菌病研究概况
• 1.1.1 病原学及流行病学
• 1.1.2 鸭大肠杆菌病疫苗研究概况
• 1.2 鸭巴氏杆菌病概况
• 1.2.1 病原学及流行病学
• 1.2.2 鸭巴氏杆菌疫苗研究概况
• 1.3 间接酶联免疫技术在禽细菌性疾病抗体检测中的应用
• 2 本研究的目的意义
• 3 实验材料、内容和方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器及应用软件
• 3.1.5 其它试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌种复壮及毒力测定
• 3.2.2 疫苗制备
• 3.2.3 疫苗无菌检验
• 3.2.4 疫苗安全性检验
• 3.2.5 最佳免疫剂量筛选
• 3.2.6 疫苗保存期测定
• 3.2.7 免疫接种及攻毒保护试验
• 3.2.8 体液免疫和细胞免疫检测
• 4 试验结果
• 4.1 疫苗的物理性状和无菌检验结果
• 4.2 疫苗安全性试验结果
• 4.3 毒力测定结果
• 4.4 疫苗最佳免疫剂量筛选结果
• 4.5 免疫效力试验结果
• 4.6 疫苗保存期试验结果
• 4.7 抗体消长规律检测结果
• 4.8 微量凝集检测法与间接ELISA法检测抗体敏感性比较
• 4.9 T细胞免疫水平
• 5 讨论
• 5.1 疫苗制备、最佳免疫剂量和安全性检验
• 5.2 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗的免疫效力
• 5.3 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗免疫鸭后的抗体水平
• 5.4 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗免疫鸭后的T细胞免疫水平
• 5.5 蜂胶佐剂对细胞免疫的影响
• 5.6 间接ELISA法与微量凝集检测法检测抗体敏感性比较
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的学术论文目录