IFN-γ和PTX3对牛分枝杆菌和BCG差异诱导树突状细胞免疫效应的机制研究

论文摘要

牛结核病（Bovine Tuberculosis,bTB）是一种严重危害养牛业的、人畜共患的慢性消耗性传染病,主要由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M. bovis）感染所致。牛结核病的流行不仅严重影响到了畜牧业的健康持续发展,而且对人类的健康和人类结核病的防控也造成了巨大的障碍。卡介苗（BCG）是强毒性牛分枝杆菌经历230代传代后的减毒株,作为疫苗应用已有多年的历史,但仍有不足之处。先天免疫和特异性的细胞免疫是机体抵抗结核感染的主要机制。从个体发育来看,当抗原物质入侵机体以后,首先发挥作用的是先天免疫,而后产生特异性免疫。因此,先天免疫是一切免疫防护能力的基础。树突状细胞（DCs）是体内最强大的专职抗原递呈细胞（APC）,是唯一能够激活幼稚T细胞的APC,也是结核分枝杆菌在体内的宿主细胞,在抗感染和免疫中具有重要意义。IFN-γ是控制结核感染的关键性Th1型细胞因子,可以诱导Th0细胞向Th1细胞分化,活化更多对杀死或抑制结核分枝杆菌有非常重要作用的细胞毒性T细胞（CTL）和效应细胞,增加巨噬细胞清除结核分枝杆菌的能力。IFN-γ被认为是最主要的能激活巨噬细胞抵抗细胞内病原体的先天免疫因子。PTX3是先天体液免疫很重要的一个成分,在炎症反应和防御某些肺部病原体感染中发挥着重要作用。多种微生物成分能通过相关的Toll样受体被识别并激活树突状细胞,经由相应的信号传导通路诱导PTX3的产生。本研究试图用牛分枝杆菌和BCG作为模式菌,用树突状细胞作为体外感染的模式细胞,来探索先天免疫分子IFN-γ和PTX3在不同毒力株牛分枝杆菌差异诱导DCs免疫学效应的影响,以期阐释毒力株牛分枝杆菌持续感染、逃避免疫和BCG疫苗保护作用或保护力不够的原因。主要研究内容及结果如下：（1） IFN-γ对不同毒力株M. bovis感染DCs分泌细胞因子的影响通过ELISA检测IL-4发现,BCG感染组中IFN-γ对IL-4的分泌没有什么影响。在M.bovis感染组,IFN-γ在12小时对IL-4的分泌起显著抑制作用。对IL-10检测发现,BCG感染组的三个时间点,IFN-γ均能显著抑制IL-10的分泌,而在M.bovis感染组,IFN-γ对IL-10的分泌几乎没有影响。检测IL-12发现,在BCG感染组,IFN-γ能降低IL-12的分泌,其中,12小时和24小时时差异显著,而在M.bovis感染组中,三个时间点的IFN-γ均能显著提高IL-12的分泌。ELISA检测TNF-α发现,IFN-γ在三个时间点的两个感染组中均能显著促进TNF-α的分泌。（2）不同毒力株M. bovis差异诱导DCs分泌PTX3及信号通路的探索实验发现与空白组相比,BCG和M. bovis都能显著刺激DCs分泌PTX3。可是,M.bovis感染组的PTX3分泌量要显著少于BCG感染组。信号通路研究发现在BCG感染的DCs中,TLR2、TLR4和NF-κB的阻断均显著抑制PTX3的蛋白分泌,而在M. bovis感染的DCs中,TLR2和TLR4的阻断没有阻碍PTX3的分泌；NF-κB阻断对PTX3的影响与BCG感染组一致。说明PTX3的分泌在BCG感染组中是受TLR2和TLR4/NF-кB信号通路的调节,在M.bovis感染组,NF-κB的阻断能显著下调PTX3的分泌。研究发现利用单抗阻断PTX3后DCs的成熟分化受到一定的抑制,说明PTX3有利于DCs的成熟和分化。（3） IFN-γ、IL-1β、TNF-α、PGE2对感染不同毒力株M. bovis的DCs分泌PTX3的影响IFN-γ预处理实验发现,在BCG感染组中,IFN-γ对PTX3表达以抑制为主而在M.bovis感染组则发现IFN-γ对PTX3 mRNA转录水平截然不同的影响,在12小时和24小时,IFN-γ均显著诱导PTX3 mRNA的转录水平。IL-1β预处理实验发现,在BCG感染组中,IL-1β能显著诱导PTX3的分泌,并且具有浓度依赖性,在M. bovis感染组中则显示低浓度对PTX3的表达起促进作用,高浓度则为抑制作用。TNF-α预处理实验发现,在BCG感染组中,TNF-α在低浓度时能浓度依赖性诱导PTX3的分泌,但是过高的TNF-α则对PTX3分泌的促进作用受到抑制。在M.bovis感染组表现一定的浓度依赖性抑制PTX3的表达。PGE2预处理实验发现,当PGE2浓度达到一定水平时（200ng/mL）对PTX3的分泌具有浓度依赖性的抑制作用。还发现PGE2对DCs作用时间的长短也对PTX3的分泌造成影响,作用24小时时,PGE2对PTX3的分泌具有浓度依赖性的抑制作用,但是当作用时间长达36小时时,不同浓度的PGE2能显著抑制PTX3到一致的低蛋白水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 结核病概况
• 1.2 结核病的感染与免疫
• 1.3 树突状细胞在结核免疫中的作用
• 1.4 细胞因子与结核的感染和免疫
• 1.5 PTX3的研究进展
• 1.5.1 PTX3的基因结构与产生
• 1.5.2 PTX3抗病功能
• 2 研究目的及意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株及实验动物
• 3.1.2 树突状细胞
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 实验所用引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 树突状细胞的培养与鉴定
• 3.2.1.1 树突状细胞的培养
• 3.2.1.2 树突状细胞的鉴定
• 3.2.2 细菌感染树突状细胞
• 3.2.3 样品收集与处理
• 3.2.4 RNA的提取
• 3.2.5 反转录cDNA第一链的合成
• 3.2.6 荧光定量PCR反应
• 3.2.7 PTX3的ELISA检测
• 3.2.8 IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α的ELISA检测方法
• 3.2.9 数据分析
• 4 结果和分析
• 4.1 树突状细胞的鉴定
• 4.2 IFN-γ对不同毒力的牛分枝杆菌差异诱导DCs分泌细胞因子的影响
• 4.2.1 IFN-γ对IL-4的影响
• 4.2.2 IFN-γ对1L-10的影响
• 4.2.3 IFN-γ对IL-12的影响
• 4.2.4 IFN-γ对TNF-α的影响
• 4.3 牛分枝杆菌强弱株差异诱导DCs分泌PTX3及其信号通路的研究
• 4.4 IFN-γ、IL-1β、TNF-α、PGE2差异诱导DCs分泌PTX3的研究
• 4.4.1 IFN-γ对PTX3的影响
• 4.4.2 IL-1β对PTX3的影响
• 4.4.3 TNF-α对PTX3的影响
• 4.4.4 PGE2对PTX3的影响
• 4.5 PTX3阻断对DCs成熟分化的影响
• 5 讨论
• 5.1 IFN-γ对不同毒力牛分枝杆菌感染DC分泌细胞因子的差异调节
• 5.2 PTX3在结核感染和BCG免疫中的调节效应
• 5.3 PTX3有利于DCs的分化和抗原提呈作用
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢