大豆复合微生物肥料功能菌系的构建及包埋固定化研究

论文摘要

化学肥料的应用虽然促进了作物产量的提高,但若长期大量施用,就会破坏土壤结构、导致土壤肥力下降,不但使增产效益明显下降,甚至会污染环境。和化肥相比,微生物肥料在提高肥料利用率、增加作物产量和保护生态环境方面具有明显的优势。深入开展微生物肥料研究,对于实现农业可持续发展具有非常重要的意义。为此,本文针对目前大豆接种剂活体菌功能单一和剂型局限性的问题,采取田问取样、室内分离鉴定、盆栽试验和化验分析相结合的手段,开展了大豆复合菌剂功能菌株筛选、菌系构建及包埋固定化研究,系统地评价了包埋菌剂的综合性能,以期为大豆新型微生物肥料品种的开发应用提供理论依据。1.完成了田间采集样品的菌株分离、筛选、性能测试,并进行了分类鉴定：（1）获得3株大豆根瘤菌R12、R6和R18,其中R12在促进根瘤数、根瘤干重和固氮酶活性增加,改善大豆生长性状,促进养分吸收和提高等方面,均优于参照菌USDA110; R12抗逆性优于USDA110,且表现出解磷活性；R6和R18不具有解磷活性,其他各项指标与参照菌USDA110相比或相等、或略低、或略高；3株菌都属于根瘤菌属（Rhizobium sp.）, R12为菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）, R6和R18同为热带根瘤菌（Rhizobium tropici）的不同菌株。（2）获得2株解磷细菌S7和S1。对测试的4种无机难溶磷酸盐溶P量S7为174.8mg/L、S1为167.3m∥L,较参照菌1203分别提高了5.87%和1.33%；对卵磷脂的解P量S7为49.33mg/L,S1为54.82mg/L,参照菌1203为52.93mg/L,解卵磷脂量S7略低于参照菌,S1略高于参照菌。相对而言,S7偏好溶无机磷,S1偏好解有机磷。S7和S1对无机和有机非溶性磷的总溶P量较参照菌分别提高了2.80%和1.88%。S7为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的成员,S1为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的成员。（3）获得1株解钾菌株Cl,培养7d时其解K量为21.31mg/L,较参照菌L-K提高了34.28%；Cl为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）。2.对筛选获得的3类菌性能优良的菌株进行了拮抗性和生长关系试验,确定了能共处的菌株组合,优化了混合培养基质和培养条件,改进了培养方法：（1）明确了R12、S7和Cl之间无生长抑制现象,3种菌混合培养时的生长关系为R12和S7、R12和Cl生长上相互促进,S7与Cl为无关共栖关系。（2）优化后用于混合培养的基质成分为：甘露醇10g,酵母膏1.0g, NaCl0.1g,（NH4）2SO40.5g, K2HPO40.5g, KCl0.2g, MgSO4·7H2O1.0g, MnSO40.004g, CaCO35.0g, FeSO4·7H2O0.003g, CaCl20.1g,钾长石粉2.0g,磷矿粉5.0g,卵磷脂2.0g,Rh溶液4.0mL,蒸馏水1L。培养条件和培养方法为：按R12→S7→C1接种顺序,间隔12h,最适pH7.0,最适温度28℃。3.进行了组合菌系包埋固定化试验,考察包埋材料组成对包埋操作、颗粒基本性能等指标的影响,并进行了不同剂型之间菌体抗逆性比较：（1）初步确定包埋剂主料浓度及配比为SA3.0%-PVA3.0%,在此条件下,包埋的操作性、成球性,以及颗粒机械强度、传质性、包埋率、活菌数及其增殖倍数均较好。（2）优化的包埋剂组成为SA3.0%-PVA（2.5%-3.0%）-（SiO24.0%-CaCO30.3%）,在此条件下,操作性、成球性和传质性较好,所得包埋颗粒呈规则球形,直径为3mm-4mm,机械强度为53.4g/g-59.6g/g,包埋率为91.4%-94.3%,经过72h增殖培养,活菌数达到1011个/g,增殖倍数为500倍以上,活菌释放率达到90%以上。（3）颗粒菌剂菌体的耐盐性、耐酸碱性、耐旱性、耐冷热性和耐药性等均较液体菌剂和草炭粉剂有明显的提高。4.化肥、草炭粉剂、包埋菌剂的大豆盆栽比较试验,综合评价了菌剂效果,并明确了较佳的施用方法：（1）菌剂的施用提高了大豆产量和品质,增加了大豆结瘤量、固氮量和养分吸收,改善了大豆生物学性状、土壤有效养分供应能力和土壤生物环境。（2）菌剂与化肥配施互作效应显著,好于单施菌剂和单施同量化肥。（3）包埋菌剂与半量化肥配施效果最好,各项指标均好于全量化肥处理；继续增加化肥配施量互作效应减弱。（4）不论单施或与化肥配合施用包埋菌剂均好于草炭粉剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物肥料概述
• 1.1.1 微生物肥料定义
• 1.1.2 微生物肥料的种类
• 1.1.3 微生物肥料的理论基础
• 1.1.4 微生物肥料的作用
• 1.1.5 微生物肥料发展趋势
• 1.2 固氮微生物概述
• 1.2.1 土壤中氮素来源、形态和含量
• 1.2.2 生物固氮
• 1.2.3 生物固氮机制
• 1.2.4 根瘤菌的种类
• 1.2.5 根瘤菌的研究历史与现状
• 1.2.6 影响根瘤菌占瘤率和结瘤能力的环境因素
• 1.3 溶磷微生物概述
• 1.3.1 土壤中磷的形态
• 1.3.2 土壤中溶磷微生物的种类、数量及分布
• 1.3.3 溶磷微生物的解磷机理
• 1.4 解钾微生物概述
• 1.4.1 土壤钾素的形态与土壤钾细菌
• 1.4.2 解钾菌的解钾机理
• 1.5 微生物混合培养的意义
• 1.6 微生物细胞包埋固定化技术及研究进展
• 1.6.1 细胞固定化技术定义
• 1.6.2 细胞固定化的方法
• 1.6.3 细胞包埋固定化常见载体性能比较
• 1.6.4 包埋固定化技术原理
• 1.6.5 包埋法对细胞活性的影响
• 1.6.6 细胞包埋固定化技术的研究现状
• 1.7 根瘤菌剂研究现状、市场前景、存在问题
• 1.7.1 国内外根瘤菌剂研究现状和市场前景
• 1.7.2 根瘤菌剂研究和应用存在问题
• 1.8 本项研究的目的、意义和主要内容
• 第二章 功能菌株的筛选及鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 分离菌株的材料
• 2.1.2 供试植物
• 2.1.3 参照菌
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大豆根瘤菌的筛选
• 2.2.2 磷细菌的筛选
• 2.2.3 钾细菌的筛选
• 2.2.4 菌株生理生化特性试验
• 2.2.5 菌株16S rRNA序列分析
• 2.3 结果分析与讨论
• 2.3.1 大豆根瘤菌的筛选
• 2.3.2 磷细菌的筛选
• 2.3.3 钾细菌的筛选
• 2.4 小结
• 第三章 菌株组合的选择
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌株拮抗试验和培养基的选择
• 3.2.2 混合培养基设计
• 3.2.3 种子液的制备
• 3.2.4 最佳碳氮源组合的优化
• 3.2.5 接种顺序试验
• 3.2.6 培养温度和pH的优化
• 3.2.7 组合菌株在优化条件下活菌数测定
• 3.3 结果分析与讨论
• 3.3.1 拮抗试验结果
• 3.3.2 最佳混合培养基
• 3.3.3 混合培养的接种顺序
• 3.3.4 混合培养最适温度和pH
• 3.3.5 组合菌株在优化条件下的生长量
• 3.4 小结
• 第四章 复合菌体的包埋固定化
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 其他试剂及器材
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 复合菌体的制备
• 4.2.2 SA-PVA浓度及配比的初步确定
• 4.2.3 添加适量的辅料后SA-PVA最佳浓度及配比的筛选
• 4.2.4 不同剂型菌剂菌体抗逆性比较
• 4.3 结果分析与讨论
• 4.3.1 包埋主料基本浓度及配比
• 4.3.2 包埋材料的优化
• 4.3.3 不同剂型菌剂菌体抗逆性比较
• 4.4 小结
• 第五章 不同剂型菌剂大豆盆栽比较试验
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试土壤
• 5.1.2 供试植物
• 5.1.3 盆栽容器
• 5.1.4 试验设计
• 5.1.5 化肥的种类和施用量
• 5.1.6 播种和日常管理
• 5.1.7 菌剂的制备和施入
• 5.1.8 采样及指标测定
• 5.1.9 培养基
• 5.2 结果分析与讨论
• 5.2.1 施用菌剂对大豆生物学性状和结瘤的影响
• 5.2.2 施用菌剂对种子产量及其构成因素的影响
• 5.2.3 施用菌剂对大豆茎氮磷钾含量的影响
• 5.2.4 施用菌剂对土壤养分含量的影响
• 5.2.5 施用菌剂对大豆根际土壤微生物数量的影响
• 5.2.6 施用菌剂对大豆种子品质的影响
• 5.3 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章