论文摘要
精氨酸激酶（Arginine Kinase, AK）（ATP:L-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）属于磷酸原激酶家族,主要存在于无脊椎动物细胞中,是脊椎动物细胞中肌酸激酶（creatine kinase, CK）的同源蛋白。AK通过催化ATP和精氨酸之间磷酸基团可逆转移,生成磷酸精氨酸和Mg2+ADP两种产物来平衡细胞内ATP含量。研究表明,CK有氧化型CK和还原型CK两种存在形式,其可逆氧化形式是形成了一个分子内二硫键所致。肌细胞内的氧化型CK可迅速被泛素化降解,从而下调CK的含量。AK分子中含有5个半胱氨酸残基,尚不清楚AK是否也存在类似的可逆氧化形式。本研究以刀额新对虾AK为对象,通过非还原SDS-PAGE电泳发现,Wt-AK及其突变体R330K均存在氧化型和还原型两种形式。R330K比Wt-AK更容易被氧化,并且氧化型R330K可被DTT逆转,提示氧化形式可能是由于分子内半胱氨酸残基之间形成了二硫键所致。应用定点突变技术,分别将Wt-AK及其突变体R330K的23号位、127号位、139号位、201号位和271号位共5个半胱氨酸残基（Cys）突变为丝氨酸（Ser）,构建了AK的5个单突变体（C23S, C127S, C139S, C201S和C271S）和5个双突变体（C23SR330K, C127SR330K, C139SR330K, C201SR330K和C271SR330K）。突变体蛋白的非还原SDS-PAGE电泳实验结果表明：氧化型AK和氧化型R330K的出现是由于其中Cys201与Cys271残基之间形成了分子内二硫键所致。一些氨基酸残基在维持AK结构稳定性和催化活性中的作用己有报道。序列比对结果表明,9个带正电荷的精氨酸残基（R124, R126, R129, R208, R229, R245, R280, R309和R330）在AK和CK家族中高度保守。越来越多的证据表明,其中的5个保守精氨酸残基（R124,R126,R229,R280,和R309）与催化磷酰基团转移有关。R330发挥何种作用尚不清楚。应用定点突变技术,将AK中Arg330突变为Lys,即构建了突变体R330K。生化分析实验显示：与野生型AK相比,R330K突变体二级结构减少,色氨酸残基微环境发生改变,疏水性表面暴露增加,并且伴随着催化活性的急剧下降,上述结果通过对AK和R330K结构同源模建得以进一步证实。本研究证明了R330残基在AK结构稳定性和活性维持中起着重要作用。热变性AK和盐酸胍变性后AK复性过程都会出现聚集现象,而分子伴侣能够帮助其他蛋白质避免错误折叠产生聚集。FK506结合蛋白（FK506binding protein, FKBP）12是一种单结构域的脯氨酰顺反异构酶,关于它是否具有分子伴侣活性还存在争议。我们在表达纯化野生型人FKBP12（Wt-hFKBP12）的基础上,采用凝胶排阻层析、戊二醛交联和CTAB电泳等技术,发现经SDS-PAGE检测为均一纯的Wt-hFKBP12有三种存在形式：即单体、二聚体和三聚体。构建、表达与纯化了带有6个组氨酸标签的重组蛋白hFKBP12（His）。分别比较了其与Wt-hFKBP12的热稳定性和PPIase活性,发现二者PPIase活性基本一致,在65℃以下时热稳定性也基本一致。在此基础上,分别探讨了hFKBP12对热变性精氨酸激酶的聚集和盐酸胍变性后AK复性过程中聚集的影响,结果发现hFKBP12未能有效抑制AK的聚集。大分子拥挤是活细胞中普遍存在的现象,它对细胞内各种酶的功能有显著影响。目前,对大分子拥挤环境中AK的折叠过程研究未见报道。本研究分别选用PEG2000、 Dextran70和Ficoll70作为大分子拥挤试剂,检测了脲变性精氨酸激酶在不同拥挤试剂中的复性动力学变化规律。结果表明：三种拥挤试剂（浓度为100g/L）能显著加快精氨酸激酶重折叠的快相速率,但在一定程度上使精氨酸激酶正确折叠产率下降。