甜瓜果实蔗糖代谢相关酶基因的克隆、表达分析及Anti-CmSPS1对甜瓜的遗传转化

论文摘要

甜瓜（Cucumis melon L.）是世界性的重要园艺作物,糖分组成及含量是衡量甜瓜品质的主要依据之一。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果实中主要的可溶性糖,其含量和组成对果实品质起重要作用,它们的含量和组成严格受蔗糖代谢酶调控,而蔗糖代谢酶包括蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和转化酶（AI）,其中SPS活性的提高和AI活性的降低是蔗糖积累的首要条件,改变SPS的活性可能会改变蔗糖的代谢模式。因此,利用现代分子生物学的方法改变蔗糖代谢酶的活性对甜瓜品质育种具有重要的意义。本研究首先通过RT-PCR及3′、5′RACE技术克隆到甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因和酸性转化酶基因全长cDNA,研究了这两个基因的组织器官表达特异性和果实发育过程中的表达特异性,然后构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。以甜瓜自交系M01-3为材料,通过子房注射法将甜瓜果实反义蔗糖磷酸合成酶基因进行了甜瓜的遗传转化,得到了转基因植株。研究的主要结果如下:1.通过RT-PCR及3′、5′RACE技术克隆到甜瓜果实SPS基因和AI基因全长cDNA。测序结果表明SPS基因全长为3373 bp,编码1054个氨基酸,在GenBank中登记号为DQ521271,命名为CmSPS1;AI基因全长为2178 bp,编码636个氨基酸,在GenBank中登记号为EU260044,命名为CmS-AIV1。2.通过Northern Blot分析得知,在甜瓜的不同组织中,CmSPS1基因在叶片、茎、果实中均有表达,而在根和花中未检测到该基因的表达,而CmS-AIV1基因在花和果实中表达,在根、茎、叶中不表达。在甜瓜果实生长发育过程中,在20 DAP之前没有检测的CmSPS1基因的表达,在20 DAP之后,该基因开始表达,到果实成熟时表达量最高;而CmS-AIV1基因的表达情况与之相反,随着果实的成熟表达量逐渐降低。3.将克隆在pMD18-T载体上的甜瓜CmSPS1基因用HincⅡ和KpnⅠ进行酶切,酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后回收830 bp的片段,将该片段与经KpnⅠ和SmaⅠ酶切的植物表达载体pROK2进行连接,这样获得的重组质粒CmSPS1片段反向插入35S启动子之后,TNOS终止子之前。经酶切和PCR检测表明,我们成功构建了甜瓜反义CmSPS1基因的植物表达载体。4.本研究利用子房注射法将anti-CmSPS1基因对甜瓜进行了遗传转化,应用PCR和PCR Southern Blot技术对后代进行了分子鉴定,在获得的800株成苗中,共鉴定出2株转基因植株,转化效率为0.25%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 第一部分 引言
• 1 甜瓜果实糖分积累特点
• 2 甜瓜蔗糖代谢相关酶在蔗糖代谢中的作用
• 3 蔗糖磷酸合成酶的研究进展
• 3.1 SPS 的生物学功能
• 3.2 SPS 在蔗糖代谢中的作用
• 3.2.1 SPS影响源强和库强
• 3.2.2 SPS调节光合产物在蔗糖和淀粉之间的分配
• 3.2.3 SPS是合成蔗糖的关键酶之一
• 3.2.4 SPS 可提高瓜果的品质
• 3.2.5 SPS 参与细胞分化与纤维细胞壁合成
• 3.3 SPS 基因研究现状及应用
• 3.3.1 SPS 基因的表达调控
• 3.3.2 SPS 基因的克隆及遗传转化植株的表现
• 4 反义技术的研究
• 4.1 反义技术的概念及作用原理
• 4.2 反义核酸技术在植物基因工程中的应用
• 5 本研究的目的与意义
• 第二部分 甜瓜果实蔗糖代谢相关酶基因的克隆及表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、试剂及试验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 甜瓜果实总RNA 的提取
• 1.2.2 甜瓜果实SPS 基因的克隆
• 1.2.3 甜瓜果实 AI 基因的克隆
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.5 目的片段的回收
• 1.2.6 连接反应
• 1.2.7 转化
• 1.2.8 重组子的PCR及酶切鉴定
• 1.2.9 测序及序列分析
• 1.2.10 CmSPS1 和 CmS-AIV1 的表达特性分析
• 1.2.11 甜瓜果实生长发育过程中蔗糖含量及SPS 和AI 活性的变化
• 2 结果与分析
• 2.1 甜瓜果实总RNA 的提取
• 2.2 甜瓜果实SPS 基因的克隆
• 2.2.1 甜瓜果实SPS 基因中间片段的克隆
• 2.2.2 甜瓜果实SPS 基因3′端的克隆
• 2.2.3 甜瓜果实SPS 基因5′端的克隆
• 2.3 CmSPS1 氨基酸序列分析及同源性比较
• 2.4 甜瓜果实 AI 基因 5′ 端及 3′ 端的克隆
• 2.5 CmS-AIV1氨基酸序列分析及同源性比较
• 2.6 CmSPS1 和 CmS-AIV1 的表达特性分析
• 2.6.1 CmSPS1 基因在甜瓜不同组织中的表达分析
• 2.6.2 CmSPS1 基因在甜瓜果实生长发育过程中的表达特性分析
• 2.6.3 CmS-AIV1基因在甜瓜不同组织中的表达分析
• 2.6.4 CmS-AIV1基因在甜瓜果实生长发育过程中的表达特性分析
• 2.7 甜瓜果实生长发育过程中蔗糖含量及SPS 和AI 活性的变化
• 3 讨论
• 3.1 关于甜瓜总 RNA 的提取
• 3.2 RT-PCR 反应条件的优化
• 3.3 RACE 技术在基因克隆中的作用及引物设计原则
• 第三部分 甜瓜果实 CmSPS1 反义表达载体的构建及反义转基因植株的获得
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 分子生物学与生化试剂
• 1.1.4 35S 启动子和 TNOS 终止子引物的合成
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 目的基因片段的获得
• 1.2.2 表达载体pROK2 的酶切反应及所得片段的回收
• 1.2.3 连接反应
• 1.2.4 热激法转化E.coli DH5a
• 1.2.5 重组质粒的筛选及菌液的保存
• 1.2.6 重组质粒的鉴定方法
• 1.2.7 子房注射法转化甜瓜
• 1.2.8 筛选转基因阳性植株
• 2 结果与分析
• 2.1 利用PCR验证重组质粒
• 2.2 利用酶切进行鉴定
• 2.3 转基因植株的鉴定
• 2.3.1 转基因植株的PCR鉴定
• 2.3.2 PCR Southern Blot鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于酶切和连接
• 3.2 关于标记基因的切除
• 3.3 关于反义技术在植物基因工程中的应用
• 3.4 子房注射法在甜瓜转基因上的应用
• 3.5 PCR 法在鉴定转基因植株中的应用
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文