PTEN与VEGF在原发性肝细胞癌中的表达及相互作用

论文摘要

第一部分PTEN与VEGF在原发性肝细胞癌中的表达及其意义一PTEN在原发性肝细胞癌中表达及其意义目的:检测第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因（PTEN）蛋白及mRNA在肝细胞癌和癌旁组织中的表达,并分析和探讨PTEN表达情况与HCC发生、发展、侵袭性及转移的关系和临床意义。方法:利用免疫组织化学链霉素亲合素—生物素—过氧化物酶复合物（SP）法、半定量逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测60例肝细胞癌及癌旁组织中PTEN mRNA及蛋白表达,并进一步比较分析PTEN mRNA及蛋白表达在二者中的差异。结果:1、与癌旁肝组织相比,肝细胞癌组织PTEN蛋白阳性表达强度平均A值明显弱,两组差异具有显著统计学意义（t=3.29,P<0.05）。2、与癌旁肝组织相比,肝细胞癌组织中PTENmRNA表达阳性率和半定量RT-PCR产物测得平均灰度值都低,差异有显著统计学意义（t=25.034,P<0.01）。3、在不同分级的肝细胞癌组织中,PTEN蛋白的表达在分化较好的Ⅰ～Ⅱ级明显强于Ⅲ～Ⅳ级,差异有显著统计学意义（t=26.009,P<0.01）,且随肿瘤侵袭性增强及临床进展期增加而表达明显降低（P<0.01）,但与患者性别、肿瘤大小、AFP水平均无显著相关性（P>0.05）。结论:PTEN蛋白及mRNA在肝细胞癌组织中的表达阳性强度明显低于癌旁组织中,并与肝细胞癌组织分化程度和侵袭性呈负相关。因此我们推断PTEN基因表达率的高低可能与肝细胞癌的发生及预后均有关,PTEN表达水平一定程度上能反映肝细胞癌组织分化和侵袭性强弱,PTEN表达缺失提示肝细胞癌患者预后较差。二VEGF在原发性肝细胞癌中的表达及其意义目的:检测血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及mRNA在肝细胞癌和癌旁组织中的表达,并分析和探讨VEGF表达情况与HCC发生、发展、侵袭性及转移的关系和临床意义。方法:利用免疫组织化学链霉素亲合素—生物素—过氧化物酶复合物（SP）法、半定量逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测60例肝细胞癌及癌旁组织中VEGF mRNA及蛋白表达,并进一步比较分析VEGF mRNA及蛋白表达在二者中差异。结果:1、肝细胞癌组织中VEGF阳性表达强度明显强于癌旁肝组织,两组差异具有非常显著统计学意义（t=27.843,P<0.05）。2、肝癌组织中VEGF mRNA阳性率为76.67%,癌旁肝组织阳性率为26.77%,即肝癌组织VEGF mRNA阳性表达明显高于癌旁肝组织,差异有显著统计学意义（t=27.372,P<0.01）。3、VEGF蛋白及mRNA表达随肿瘤侵袭性及临床进展的增强明显增加（P<0.01）;但与患者性别、肿瘤大小、AFP水平和组织病理分级无显著相关性（P>0.05）。结论: 1、VEGFmRNA及蛋白在肝细胞癌组织中阳性表达不仅明显高于癌旁肝组织,而且随癌组织侵袭性及患者临床恶性进展程度增加而增强,这可能是由于HCC进展过程中,需要大量新生血管为其提供氧和营养物质,因而,肿瘤侵袭性强、临床恶性程度高者,VEGF转录、翻译表达均增加,VEGF表达水平一定程度上能反映肝细胞癌组织分化和侵袭性强弱,肝细胞癌组织分化程度、侵袭性与VEGF表达呈正相关。2、本研究观察到,VEGF主要在HCC细胞表达,而血管内皮细胞仅个别弱表达,从而推测,VEGF可以通过自分泌机制作用于自身肿瘤细胞,也可能以旁分泌途径作用于血管内皮细胞,具体机制有待进一步实验证实。三PTEN、VEGF和MVD在原发性肝细胞癌中相关性及其与临床病理特征的关系目的:肝细胞癌是富含血管的实体瘤,血管生成在其发生、发展和侵袭、转移中起着重要的作用。本课题的前期实验提示观察PTEN与VEGF表达与肝细胞癌的发生、发展和侵袭、转移起一定的作用,其水平一定程度上能反映肝细胞癌组织分化和侵袭性强弱,本实验观察PTEN与VEGF在肝细胞癌中表达的相关性和肝细胞癌血管形成的关系。方法:采用免疫组织化学链霉素亲合素—生物素-过氧化物酶复合物（SP）法、半定量逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测60例HCC及癌旁组织中PTEN与VEGF蛋白及mRNA表达和微血管密度。结果:1、肝细胞癌组织MVD较癌旁组织明显增高,肝细胞癌组织中,MVD平均值为49.7±12.1,其表达随肿瘤组织大小、临床恶性程度和肿瘤侵袭性增加,MVD数值明显增高（P<0.05）,差异有显著统计学意义;但与组织病理分级、AFP水平无显著差别（P>0.05）,与肝细胞癌组织分化程度无关。2、Pearson相关分析示PTEN与VEGF两者mRNA及蛋白阳性表达强度在肝细胞癌组织中呈明显负相关,相关系数分别为r=-0.613、-0.572,P<0.01,即两种基因在转录、翻译水平上均呈负相关性,且具有显著统计学意义。3、肝癌组织中,MVD与PTEN蛋白表达呈负相关,相关系数为r=-0.439,P<0.01;而与VEGF表达呈正相关,相关系数为r=0.645,P<0.01,具有显著统计学意义。结论:1、PTEN和VEGF蛋白表达呈负相关性,从而表明VEGF异常激活可能与PTEN基因表达缺失有密切关系。在肝细胞癌中PTEN可能具有负向调节VEGF mRNA及其蛋白表达作用,这在临床上有一定意义,即可根据PTEN蛋白阳性表达情况估计HCC患者病程是否进展及有无肝内转移,初步估计预后。2、肝细胞癌组织中VEGF蛋白表达与MVD呈正相关而与PTEN蛋白表达呈负相关, MVD在肿瘤边缘部分分布最多,而且肝癌组织高侵袭区域通常位于其前沿,即周边区域,该区域癌细胞分泌VEGF等细胞因子较多,新生血管数目较丰富,更易肿瘤细胞脱离原发灶进入血管,发生侵袭和转移,提示VEGF对新生血管形成起重要作用,而高表达MVD肝癌组织较低MVD值者更易复发和转移、预后更差。第二部分PTEN质粒转染肝癌细胞对VEGF的作用及意义目的:研究PTEN质粒转染肝癌细胞HepG2细胞后,肿瘤细胞的生物学特性的变化及肿瘤细胞内VEGF的表达.方法:将携有PTEN基因的真核表达载体转染HepG2细胞,应用RT-PCR、ELISA法检测转染的肝癌细胞内PTEN、VEGF在mRNA水平的表达;应用免疫组化技术、Westen Blot等技术检测转染后肝癌细胞中PTEN、VEGF的蛋白表达;并检测转染后的细胞活力和绘制细胞生长曲线,反应PTEN过表达对肝癌细胞生物学行为的影响。结果:PTEN质粒成功转染HepG2肝癌细胞,肝癌细胞内检测到PTENmRNA及蛋白的表达;转染细胞中VEGF的表达显著下降;转染后的肝癌细胞的生长受到明显的抑制。结论:PTEN在肝癌细胞中的过表达能够有效地抑制肝癌细胞的增殖,并下调VEGF的表达,从而减少由VEGF介导的肿瘤血管形成。第三部分VEGF反义寡核苷酸转染肝癌细胞后PTEN的变化及意义目的:研究VEGF反义寡核苷酸转染肝癌细胞后,对肿瘤细胞增殖的影响和PTEN表达的变化。方法:将人工合成VEGF反义寡核苷酸转染肝癌细胞hepG2后,应用流式细胞技术检测转染效率以及肝癌细胞的凋亡,观察肝癌细胞的生长增殖的变化;同时应用RT-PCR技术检测肝癌细胞中VEGF和PTEN的表达,应用激光共聚焦显微镜观察转染前后HepG2细胞PTEN表达及其形态学的变化。结果:与对照组相比,转染后的肝癌细胞的生长和增殖受到明显的抑制,肿瘤细胞凋亡明显增加,并且与反义寡核苷酸的用量和作用时间显著相关。PTEN的表达在转染后也明显上升。结论:VEGF反义寡核苷酸转染HepG2肝癌细胞后,能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖活性,使肿瘤细胞的凋亡增加。为临床治疗肝细胞癌提供新的途径。

论文目录

• 一、前言
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、论文正文
• 第一部分 PTEN与VEGF在原发性肝癌中的表达及其临床意义
• 一.PTEN在原发性肝癌中的表达及其意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 二.VEGF在原发性肝癌中的表达及其意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 三.PTEN、VEGF和MVD在原发性肝细胞癌中的相关性及其与临床病理特征的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 PTEN质粒转染肝癌细胞对VEGF的作用及意义
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 VEGF反义寡核苷酸转染肝癌细胞后PTEN的变化及意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 五、综述
• 综述一 肿瘤抑制基因PTEN在肝细胞肝癌中的研究进展
• 综述二 VEGF和PTEN在人类肿瘤中表达相互关系研究进展
• 六、附录
• 七、致谢