论文摘要
作为细胞毒性T细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞清除病毒感染细胞和肿瘤的主要方式,穿孔素在颗粒胞吐途径引起的靶细胞凋亡过程中扮演了重要角色。当细胞毒性颗粒的成份被释放到CTL和靶细胞结合形成的免疫突触中后,靶细胞将走向凋亡。细胞毒性颗粒中含有包裹在蛋白多糖基质中的穿孔素和一类被称作颗粒酶的丝氨酸蛋白酶。穿孔素会把颗粒酶递送到靶细胞的胞质中。由于各种颗粒酶都能够独立的引起靶细胞凋亡,因此靶向性破坏小鼠的任意一种颗粒酶都只是轻微的影响了机体的免疫防护。然而,细胞毒性颗粒中却只发现了一种具有递送功能的分子（穿孔素）。因此,穿孔素基因缺陷的小鼠将发生严重的机体免疫缺陷,这些小鼠不能防范病毒感染和肿瘤。在人类,穿孔素基因的突变会导致伴有抗病毒免疫失常的家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症。尽管早在20多年前就发现了穿孔素,并随即克隆了它的基因,但是,人们至今仍不确定穿孔素发挥活性的分子和细胞学机制。穿孔素与补体分子之间具有一定的同源性。由于能够像补体那样在质膜上多聚化并形成孔道,人们原本以为穿孔素会通过它在质膜上所形成的孔道递送颗粒酶。但是,电子显微镜下观察到的穿孔素孔道（直径小于50nm）小得不足以使像颗粒酶那样的球状分子能够穿过。当又发现粒酶B在没有穿孔素的情况下一样能被内吞时,人们开始质疑穿孔素的质膜孔道这一模型。而且,人们也不知道细胞外的穿孔素怎样作用于质膜后就能够使颗粒酶从与质膜相连的内吞泡中转移到胞质中。最近的研究指出,在细胞介导的细胞毒作用中,穿孔素的确在靶细胞膜表面形成了孔道并同时导致瞬间的Ca2+内流。Ca2+内流触发了损伤后的膜修复反应,胞浆中包括溶酶体和内体的囊泡将用它们的膜结构去充填损伤的膜。同时,膜损伤也会通过靶细胞的内吞作用来去除,在这一过程中穿孔素有可能破坏了内吞泡,从而使得颗粒酶和/或它自身进入靶细胞胞质。尽管人们已经明确,转位到胞质中的颗粒酶会作用于它们相应的底物并引起细胞凋亡,但是,穿孔素是否就此完成了它的全部使命呢?为了进一步探讨靶细胞损伤后膜修复反应引发的内吞作用中穿孔素的潜在作用以及穿孔素的未知活性,本研究采用了异位表达的策略来探讨穿孔素基因的功能。通过RT-PCR我们从IL-2刺激后的人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat中获得了人穿孔素基因（PRF1）的全长cDNA。亚克隆入pcDNA3.1-A载体后命名为pcDNA3.1-A/PRF1。细胞毒性淋巴细胞中,全长型穿孔素在合成和修饰后会储存在胞浆颗粒中。然而,我们并不知道如果穿孔素被其它类型的细胞表达后会怎样发挥作用。同时,为了探讨胞质中穿孔素的潜在作用,我们还构建了氨基端除去信号肽、羧基端依据NCBI数据库信息（genbank,Accession#:NP005032.1;GI:4826942）保留至C2结构域的截短型穿孔素。由于穿孔素羧基端的天冬酰胺连接聚糖位点会在加工过程中被修饰,而且庞大的糖基化修饰会掩盖C2结构域中Ca2+依赖的磷脂结合位点并抑制穿孔素的活性,因此,去除C2结构域羧基端后的序列将有可能直接表达出有活性的穿孔素,而由于在合成时已经缺失了信号肽,这种活性穿孔素一经合成后将滞留在胞质中发挥作用。截短型穿孔素也可以被称作细胞内表达的活化型穿孔素。截短型穿孔素也被亚克隆入pcDNA3.1-A载体并命名为pcDNA3.1-A/PRF1-t1。另外,插入LacZ基因的pcDNA3.1/lacZ以及空载体pcDNA3.1-A都将作为实验中的对照质粒。用两种重组穿孔素基因瞬时转染HepG2和SK-BR-3细胞后,我们发现细胞的生长都受到了抑制。在瞬时转染的SK-BR-3细胞中,我们通过RT-PCR检测到了两种重组穿孔素基因的mRNA,同时也通过穿孔素抗体的间接免疫荧光染色检测到了两种重组穿孔素的表达。有趣的是,尽管HeLa细胞的生长在这两种基因瞬时转染后受到了与HepG2和SK-BR-3相似的抑制,但它们并不影响Jurkat细胞存活。由于我们克隆穿孔素cDNA用的正是Jurkat,这种T细胞淋巴瘤细胞对自己表达的穿孔素可能存在某种未知的保护机制。为了明确两种穿孔素基因的转染究竟引起细胞发生了怎样的变化,我们通过电子显微镜观察了瞬时转染32h后的HepG2细胞。结果发现,两种重组基因都会使大量细胞呈现核固缩、染色质凝集以及凋亡小体出现等一系列细胞凋亡的典型特征,而全长型穿孔素还引起了许多细胞的质膜破裂和电子密度降低。当使用Annexin-V/PI对转染后的细胞进行双染色时,我们发现,HepG2细胞以及SK-BR-3和HEK293细胞都出现了与电镜中的观察相一致的结果。全长和截短型穿孔素都引起了早期凋亡（Annexin-V+PI-）细胞比例的升高,而如果同时比较坏死细胞（PI+）,全长型穿孔素基因转染组总是有较高比例的PI+细胞（截短型穿孔素基因转染组PI+细胞比例较少,可能主要引起细胞凋亡）,从而也使得全长型穿孔素总的细胞杀伤效果总是强于截短型穿孔素。此外,两种基因的转染还都引起了SK-BR-3和HepG2细胞中TUNEL阳性细胞比例的增高,以及HEK293细胞中活性Caspase-3的增加。以往研究强调穿孔素主要起递送颗粒酶的作用,而颗粒酶才是决定性的凋亡执行者。然而,我们的研究发现,在没有颗粒酶的参与下,异位表达的穿孔素本身就有可能诱导凋亡。为了进一步认识穿孔素引起的细胞凋亡,我们还在转染SK-BR-3细胞32 h后通过间接免疫荧光染色检测了线粒体相关的凋亡蛋白细胞色素C（Cyt C）和凋亡诱导因子（AIF）。荧光显微镜观察发现,两种穿孔素基因的表达几乎总伴有DAPI染色下DNA的凝集和胞核的变形或破碎,同时,原本位于线粒体中的Cyt C和AIF也随着重组穿孔素的表达分别发生了显著的胞质和胞核转位。另一方面,如果在细胞转染前使用广谱的caspases抑制剂Z-VAD-FMK或者线粒体的膜电位的保护剂Bcl-XL BH44-23,全长和截短型穿孔素引起的AIF核转位、胞核破坏以及整体上的细胞死亡都受到了显著抑制。由此看来,异位表达的穿孔素可能是通过对亚细胞器（如线粒体）的破坏引起细胞凋亡。尽管异位表达的策略提示我们穿孔素具有潜在的凋亡诱导活性,但它并不一定能够反映效应细胞破坏靶细胞时穿孔素和/或颗粒酶将在免疫突触的空间局限下分别或共同进入胞质的实际情况。为了确定细胞杀伤过程中穿孔素在亚细胞水平的功能,我们还有必要建立一种免疫突触介导的效靶细胞杀伤模型。前面的实验提示Jurkat细胞在异位表达重组穿孔素时自身会受到保护,为了明确在异位表达的全长型穿孔素在Jurkat细胞中会通过什么途径发挥作用,我们将瞬时转染全长型穿孔素基因32 h后的Jurkat细胞放入transwell上室,与下室预先爬片的SK-BR-3细胞进行非接触共培养。令我们感到意外的是,Jurkat细胞表达的全长型穿孔素并没有储存在胞浆颗粒中,而是被直接分泌到了培养上清中。当共培养72 h后,爬片上的SK-BR-3中能够通过间接免疫荧光检测到穿孔素。我们还在全长型穿孔素基因转染后筛选了稳定表达穿孔素的Jurkat细胞株,通过RT-PCR验证了目的基因在建株细胞中的表达,同时也在培养上清中检测到了分泌表达的穿孔素蛋白。而建株的Jurkat细胞确实能够有效杀伤在transwell中共培养的SK-BR-3细胞。另一方面,我们也通过在免疫突触形成过程中不可或缺、同时能够有效促进NK细胞杀伤肿瘤的一对受配体分子（CD226/CD155, CD112）的相互作用,尝试在能够组成性表达CD155和CD112同时也重组表达穿孔素的建株Jurkat细胞以及能够在膜表面重组表达CD226的CHO细胞之间建立效靶细胞的杀伤模型。然而,在这两种建株细胞的混合培养实验中我们并没有观察到显著的细胞相互作用或者是细胞杀伤。综上所述,我们从Jurkat细胞克隆了全长和截短型穿孔素基因,这两种基因的异位表达都能够引起细胞凋亡,但全长型穿孔素也促进细胞坏死。细胞凋亡可能是穿孔素对亚细胞器（如线粒体）的破坏所导致,而且能够被广谱caspases抑制剂Z-VAD-FMK或者线粒体的膜电位的保护剂Bcl-XL BH44-23逆转。异位表达的策略暗示了穿孔素潜在的凋亡诱导活性,而靶细胞的凋亡有助于机体的免疫监视和免疫防御,也提示穿孔素可以作为潜在的药物用于治疗。同时,我们仍在不断尝试通过建立一种免疫突触介导的效靶细胞杀伤模型来验证我们之前的发现。本研究将为深入阐明穿孔素在免疫活性细胞杀伤靶细胞中的作用及其诱导细胞凋亡的机理提供实验依据。
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相关论文文献
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