天青蛋白高效分泌表达载体的构建及应用

论文摘要

天青蛋白是由假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分泌的一种螯合了铜离子的小分子蛋白,由128个氨基酸组成,分子量为14.6kDa,在生物体内起到氧化还原和电子传递的作用。但近几年的研究发现天青蛋白具有抗肿瘤作用,它可以与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物,从而稳定和提高p53蛋白在细胞内的水平,然后通过半胱氨酸蛋白酶介导的线粒体途径诱导细胞凋亡。现已有文献报道天青蛋白能够抑制裸鼠网状瘤J774巨噬细胞的增殖,诱导黑色素瘤UISO-Mel-2细胞、人乳腺癌MCF-7、人骨肉瘤U2OS细胞的凋亡。本研究从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2440）中PCR扩增出天青蛋白基因,利用Red/ET同源重组技术分别构建了大肠杆菌α-溶血素Ⅰ型和融合了胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB基因信号肽的Ⅱ型天青蛋白分泌表达载体,分别转入大肠杆菌BL21（DE3）,用四环素诱导表达。序列比对结果表明,来源于恶臭假单胞（Pseudom-onas putida KT2440）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）的天青蛋白基因具有81%的序列同源性。经SDS-PAGE和Western Blot检测比较,天青蛋白基因在大肠杆菌Ⅱ型分泌表达载体中能够高效分泌表达。通过镍柱亲和层析的方法纯化大肠杆菌Ⅱ型分泌系统上清中的天青蛋白,SDS-PAGE证明天青蛋白得到了很好的纯化,用纯化的蛋白作用于小鼠黑色素瘤B16细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞,MTT检测表明纯化后的天青蛋白对B16细胞和4T1细胞都具有较强的抑制作用,通过琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA Ladder条带,证明天青蛋白的作用导致了这两种细胞的凋亡。本文成功构建了能够高效分泌表达天青蛋白的大肠杆菌Ⅱ型分泌表达载体并用小鼠肿瘤细胞验证了天青蛋白的抗肿瘤作用,为进一步研究天青蛋白的抗肿瘤作用奠定了基础,为探索小分子蛋白的表达提供了新的基因重组技术。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 天青蛋白的研究背景
• 1.1 天青蛋白概述
• 1.2 天青蛋白的抗肿瘤作用
• 2 细胞凋亡与肿瘤
• 2.1 细胞凋亡概述
• 2.1.1 细胞凋亡的形态学特征
• 2.1.2 细胞凋亡的生化特征
• 2.2 细胞凋亡的分子机制
• 2.2.1 细胞凋亡的信号传导
• 2.2.2 细胞凋亡的酶学机制
• 2.2.3 p53与细胞凋亡
• 2.3 细胞凋亡与肿瘤
• 2.4 细胞凋亡与肿瘤治疗
• 3 细菌Ⅰ型和Ⅱ型分泌机制
• 3.1 细菌Ⅰ型分泌机制
• 3.2 细菌Ⅱ型分泌机制
• 3.3 Ⅰ与Ⅱ型分泌系统的应用
• 4 Red/ET同源重组
• 4.1 Red/ET同源重组的原理
• 4.2 Red/ET同源重组的优点及应用
• 5 立题依据和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株、质粒和细胞
• 1.2 培养基和抗生素
• 1.2.1 细菌用培养基和抗生素
• 1.2.2 细胞用培养基和抗生素
• 1.3 试剂和引物
• 1.3.1 工具酶及抗体
• 1.3.2 DNA沉淀用试剂
• 1.3.3 试剂盒
• 1.3.4 琼脂糖凝胶电泳试剂
• 1.3.5 大肠杆菌感受态制备和转化试剂
• 1.3.6 蛋白质电泳试剂
• 1.3.7 Western Blot所需溶液
• 1.3.8 胶酶解用试剂
• 1.3.9 蛋白纯化用溶液
• 1.3.10 Bradford工作液的配制
• 1.3.11 引物
• 1.4 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440总DNA的提取
• 2.2 PCR扩增
• 2.3 GB2005感受态细胞的制备
• 2.4 质粒pGB-Ptet CFT073 hlyABD提取以及酶切后线性片段的回收
• 2.5 大肠杆菌Ⅰ型分泌表达质粒pGB-Ptet PP azurin-hlyABD的构建
• 2.6 大肠杆菌Ⅱ型分泌表达质粒pGB-Ptet PP pel-azurin的构建
• 2.7 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.8 菌体的培养及诱导
• 2.9 细胞培养液上清中的可溶性蛋白的沉淀
• 2.10 重组菌株中天青蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.11 免疫印迹杂交鉴定（Western Blot）
• 2.12 天青蛋白的质谱鉴定
• 2.13 天青蛋白的纯化
• 2.14 Bradford法测定天青蛋白含量
• 2.15 细胞培养、增殖与传代
• 2.16 天青蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用
• 2.17 DNA电泳检测细胞凋亡
• 第三章 结果与分析
• 1 大肠杆菌Ⅰ型分泌表达质粒pGB-Ptet PP azurin-hlyABD的构建
• 2 大肠杆菌Ⅱ型分泌表达质粒pGB-Ptet PP pel-azurin的构建
• 3 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 4 重组菌株的诱导表达和SDS-PAGE检测
• 5 Western Blot分析
• 6 质谱鉴定
• 7 天青蛋白的纯化
• 8 天青蛋白的抗肿瘤作用
• 9 DNA电泳检测细胞凋亡
• 讨论
• 1 大肠杆菌Ⅰ型分泌表达载体pGB-Ptet PP azurin-hlyABD的构建
• 2 大肠杆菌Ⅱ型分泌表达质粒pGB-Ptet PP pel-azurin的构建
• 3 天青蛋白的抗肿瘤作用
• 4 Red/ET同源重组技术在构建小分子融合蛋白载体中的应用
• 主要结论和今后的研究设想
• 1 本研究的主要结论
• 2 今后工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢