基于痘苗病毒天坛株的改良载体的研究及HIV-1疫苗的构建

论文摘要

1981年以前,痘苗病毒天坛株作为天花疫苗在中国被广泛应用并为消灭天花发挥了重要作用。之前我们已经鉴定了野生型天坛株在体内体外的生物学特性,并且已经通过检测鼻腔途径导致的体重降低和直接颅腔接种鉴定了其毒力。为了开发天坛株作为活载体来构建疫苗,我们通过同源重组的方法将绿色荧光蛋白基因GFP导入到其基因组的不同位置,构建了三种改良的痘苗病毒天坛株。在Vero细胞上,基于绿色荧光蛋白的表达筛选得到了三种改良的痘苗病毒天坛株并利用Vero进行了增殖。对纯化的改良痘苗病毒天坛株在体内体外进行了遗传型和表型的鉴定。测序结果表明确实是在试验预期设计的位点发生了重组。我们发现在Vero细胞上进行多次传代以后GFP依然十分稳定,这表明三个位点都能够耐受外源基因并能够应用于将来的重组疫苗构建。我们对三种改良病毒在14种细胞上的生长特性进行了测试,跟野生型的天坛株相比,他们表现出了不同程度降低的致细胞病变病变效应和缩小的宿主范围,但表达GFP的水平相当。进一步的,我们发现在小鼠内导致体重降低的毒力跟野生型天坛株相比下降了250到1000倍以上而且在老鼠的中枢神经系统不能进行复制。与此同时,三种改良病毒都能在小鼠体内刺激产生较强的针对外源基因GFP的体液和细胞免疫反应。结合以上几点,改良病毒的复制能力能在体内产生比较高的免疫反应。在减小源自父本野生天坛株的毒力的同时,我们希望能同时保留其复制能力,以获得理想的活病毒载体应用于包括艾滋病在内的传染病的疫苗的研发。作为最初的尝试,我们还构建了融合表达华中地区艾滋病毒流行株的nef,tat和rev基因的改良痘苗病毒天坛株。通过PCR的方法,我们去除了nef的终止密码,tat的起始和终止密码以及rev的起始密码以在一个启动子控制之下进行融合表达。可以检测到融合表达的蛋白质。已经用融合表达nef,tat和rev基因的改良痘苗病毒天坛株对小鼠进行了免疫并收集了第0,3和5周的血清,在第5周时收集了小鼠脾细胞。通过Elisa检测了针对外源基因的抗体反应,现在正在进行ELISpot试验检测免疫反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 艾滋病疫苗以及痘苗病毒的研究进展
• 一、艾滋病疫苗研究进展
• 1. HIV 导致疫苗研发困难的生物学特性
• 2. HIV 感染导致的免疫反应
• 3. 已经尝试过的艾滋病疫苗
• 4. 新型艾滋病疫苗的研究策略
• 5. 展望
• 二、痘苗病毒研究进展
• （一） 痘苗病毒的分类地位及基本特点
• （二） 痘苗病毒的生活周期
• 1. 吸附进入
• 2. 脱壳
• 3. 基因的表达
• 4. DNA 的复制
• 5. 病毒的组装
• 6. 病毒的释放
• 第二章 实验研究
• 一、基于痘苗病毒天坛株的改良载体生物学特性的鉴定以及免疫效果评估
• 1、实验材料和方法
• 1.1 细胞、病毒及实验动物
• 1.2 仪器、试剂和耗材
• 1.3 实验方法
• 2、实验结果
• 2.1 改良病毒的构建及分子鉴定
• 2.2 改良病毒的遗传及表达稳定性鉴定
• 2.3 改良痘苗病毒天坛株表达外源基因水平的比较
• 2.4 改良痘苗病毒天坛株的宿主范围和体外复制特性
• 2.4.1 改良痘苗病毒天坛株在细胞中的扩散
• 2.4.2 低感染复数下改良痘苗病毒天坛株的体外复制动力学
• 2.4.3 高感染复数下改良痘苗病毒天坛株的体外复制动力学和CPE
• 2.4.4 改良痘苗病毒的形态发生
• 2.5 改良痘苗病毒天坛株在动物模型中的复制及毒力研究
• 50'>2.5.1 改良痘苗病毒天坛株的ICLD₅₀
• 2.5.2 鼻腔免疫途径改良痘苗病毒天坛株对动物体重的影响
• 2.6 小鼠对改良痘苗病毒天坛株的体液免疫反应的检测
• 2.6.1 GFP 的原核表达
• 2.6.2 Elisa 检测针对GFP 的体液免疫反应
• 2.6.3 中和实验检测针对载体的抗体效价
• 2.7 针对外源基因GFP 的细胞免疫反应的检测
• 3. 讨论
• 二、表达HIV-1 NEF-TAT-REV的初步疫苗的构建
• 1、实验材料和方法
• 1.1 细胞、病毒及实验动物
• 1.2 仪器、试剂和耗材
• 1.3 实验方法
• 2. 实验结果
• 2.1 重组病毒的获得及分子鉴定
• 2.2 重组病毒表达外源基因的检测
• 2.3 针对外源基因的抗体检测
• 3. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢