水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究

论文摘要

我国水稻秸秆资源丰富,年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇,对解决未来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸秆的主要成分是纤维素,对纤维素的利用最主要的限制性因素是将纤维素转化为可发酵还原糖。解决的办法主要有两类途径:（1）提高纤维素酶生产的经济性,主要涉及纤维素酶高产菌的获得及纤维素酶的生产技术,提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本;（2）提高纤维素酶利用效率,主要涉及纤维素酶解催化过程,以降低单位可发酵还原糖生产成本。因此,本研究从菌种的选育着手,研究了菌株的产酶特性,用响应面策略优化发酵培养基,形成了5L发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;分离纯化了纤维素酶;构建了代谢纤维二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究,利用二级串联式生物反应器耦合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如下:1.筛选到一株纤维素酶高产菌株（Penicillium YT01）,原生质体紫外诱变后得到突变株YT02,YT02以水稻秸秆为碳源,豆饼粉和硫酸铵为氮源,在29℃,初始pH6.0发酵120 h,纤维素酶活力达到最高,摇瓶发酵滤纸酶活（FPA）、CMC酶活（CMCase）和β-葡萄糖苷酶活（CB）分别达3.86 IU/mL、207.41 IU/mL和1.40 IU/mL。2.用响应面方法（RSM）优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为41.95g/L,豆饼粉为24.83g/L,麸皮为22.16 g/L,（NH4）2SO4、KH2PO4为4g/L,MgSO4为0.5g/L;起始pH6.0。以优化的培养基发酵120 h,滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到8.8967IU/mL、357.41 IU/mL and 3.704 IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。3.在5L发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响,确定了分批发酵的工艺条件为:0-32 h时发酵温度32℃,溶氧70%;32 h至120 h发酵结果发酵温度29℃,溶氧50%,发酵液初始pH值6.0,发酵96 h滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到11.13 IU/mL、465.24 IU/mL and 4.08 IU/mL,均高于摇瓶发酵水平,分批发酵动力学过程显示,突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为部分耦联。4.利用DEAE Sephadex A-25和Sephadex G-75分离纯化了二个内切葡聚糖酶（CMCase）和一个β-葡萄糖苷酶,CMCase纯化倍数为13.48,回收率为10.54%,β-葡萄糖苷酶纯化倍数为18.62,回收率为8.62%,经SDS-PAGE得到单蛋白分子条带,经分子量测定分别为73 kDa、43 kDa和57.8 kDa,并对其进行了N端测序和质谱分析。5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN-27作为工程菌株的受体菌。利用稳定性能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP,使纤维二糖代谢基因BGL1整合到酿酒酵母的染色体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径,拓展了酒精生产的底物利用范围,降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌,固定化细胞与游离细胞相比,发酵时间缩短,乙醇产率提高20%以上,并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素酶用量等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二糖酶活力较低（CB/FPA为0.38）,经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌游离细胞发酵,可部分去除纤维二糖对酶解的抑制,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌发酵,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤维素酶的协同降解机制。7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌的作用有机耦联,构建成新型的二级串联式生物反应器,在该反应器体系的协同作用下,可有效解除纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用,促进纤维原料水稻秸秆的酶水解,发酵40 h,乙醇浓度达25.5g/L,纤维素对乙醇的转化率达43.0%（纤维素对乙醇的理论转化率为56.61%）,是游离细胞同时糖化发酵（SSF）的1.65倍,生产效率达0.64g/（L·h）。采用分批添料式协同酶解发酵工艺,可提高纤维底物的终浓度达250g/L,产物乙醇的终浓度66.51g/L,有效提高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率,降低乙醇的生产成本。该反应器性能稳定,反应效率高,固定化细胞可以重复使用,便于自动化控制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 水稻秸秆资源及其降解方式
• 1.1 水稻秸秆的组成与结构
• 1.2 水稻秸秆的预处理
• 1.2.1 物理方法预处理水稻秸秆
• 1.2.2 化学方法预处理水稻秸秆
• 1.2.3 生物方法预处理水稻秸秆
• 1.3 水稻秸秆纤维素的降解方式
• 1.3.1 水稻秸秆的酸水解
• 1.3.2 水稻秸秆的酶水解
• 2 纤维素酶的性质与用途
• 2.1 纤维素酶的多酶体系
• 2.2 纤维素酶的分子结构
• 2.3 纤维素酶的作用机理
• 2.4 纤维素酶的分子量大小
• 2.5 纤维素酶的最适反应条件与稳定性
• 2.6 纤维素酶的应用
• 3 纤维素酶的生产
• 3.1 纤维素酶的生产菌种选育
• 3.2 纤维素酶的生产
• 4 水稻秸秆原料生物转化燃料乙醇
• 4.1 燃料乙醇的优越性和使用现状
• 4.2 水稻秸秆纤维素生物转化燃料乙醇的方法
• 4.2.1 分步水解发酵法生产燃料乙醇
• 4.2.2 同步糖化发酵法生产燃料乙醇
• 4.2.3 固定化细胞发酵生产燃料乙醇
• 4.3 酿酒酵母途径工程应用于燃料乙醇的生产
• 5 本研究的目的、意义和主要内容
• 5.1 本研究的目的和意义
• 5.2 本研究的思路和技术路线
• 5.3 本研究的主要内容
• 第二章 纤维素酶高产菌株的选育及产酶条件研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂与溶液配制
• 1.1.2 菌种与菌种分离源
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 水稻秸秆的预处理
• 1.2.2 纤维素酶高产菌的分离与纯化
• 1.2.3 纤维素酶高产菌的初步鉴定
• 1.2.4 纤维素酶高产菌的原生质体紫外诱变
• 1.2.5 YT02产纤维素酶的液体发酵培养方法
• 1.2.6 不同预处理水稻秸秆的酶水解
• 1.2.7 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同预处理水稻秸秆的各组分含量
• 2.2 纤维素酶高产菌的分离与筛选
• 2.3 纤维素高产菌YT01的菌种鉴定
• 2.4 纤维素酶高产菌YT01的原生质体紫外诱变
• 2.5 液体发酵培养基成分与发酵条件对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.1 不同碳源对YT02产酶的影响
• 2.5.2 不同预处理水稻秸秆对YT02产酶的影响
• 2.5.3 不同氮源对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.4 微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.5 不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响
• 2.5.6 起始pH对YT01产纤维素酶的影响
• 2.5.7 装液量对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.8 转速对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.9 培养温度对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.10 接种量对YT02产纤维素酶的影响
• 2.5.11 培养时间对YT02产酶的影响
• 2.6 纤维素酶的酶学性质研究
• 2.6.1 温度对纤维素酶各组分酶活的影响
• 2.6.2 pH对纤维素酶各组分酶活的影响
• 2.7 纤维素酶对不同预处理水稻秸秆的酶解试验
• 3 结论与讨论
• 3.1 关于筛选出的纤维素酶高产菌株
• 3.2 纤维素酶生产菌的改造
• 3.3 青霉YT02产酶条件与酶学特性
• 第三章 YT02产纤维素酶发酵培养基的优化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 供试菌种
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验设计
• 1.2.2 培养方法
• 1.2.3 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 部分因子实验筛选发酵培养基的主要影响因子
• 2.2 最陡爬坡实验逼近发酵培养基最优点
• 2.3 中心组合设计优化YT02发酵培养基组成
• 2.4 发酵过程中pH、残余还原糖与纤维素酶变化的测定结果
• 3 结论与讨论
• 第四章 YT02分批发酵产纤维素酶的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 用于分批发酵的种子培养
• 1.2.2 恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响
• 1.2.3 变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响
• 1.2.4 溶氧量对YT02分批发酵产纤维素酶的影响
• 1.2.5 分段溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响
• 1.2.6 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵温度对YT02产纤维素酶的影响结果
• 2.2 变温发酵对YT02产纤维素酶的影响结果
• 2.3 溶氧对YT02产纤维素酶的影响结果
• 2.4 分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶的影响结果
• 3 结论与讨论
• 第五章 YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 常用储备液及缓冲液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛋白质浓度的测定方法
• 1.2.2 纤维素酶的分离纯化
• 1.2.3 纤维素酶SDS-PAGE凝胶电泳纯化及酶相对分子量的测定
• 1.2.4 酶蛋白的N端测序
• 1.2.5 酶蛋白的质谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析结果
• 2.1.1 层析收集管酶蛋白同洗脱缓冲液NaCl浓度的关系
• 2.1.2 层析收集管酶蛋白活性检测
• 2.2 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析结果
• 2.2.1 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白
• 2.2.2 分子筛凝胶过滤层析纤维素酶活测定结果
• 2.3 纤维素酶各纯化步骤纯化情况
• 2.4 SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳
• 2.4.1 SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳银染结果
• 2.4.2 纤维素酶分子量SDS-PAGE凝胶电泳测定结果
• 2.5 酶蛋白的N端测序结果
• 2.6 酶蛋白的质谱分析结果
• 3 结论与讨论
• 第六章 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及其细胞固定化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 分子克隆用酶和试剂
• 1.1.3 水稻秸秆水解液的制备
• 1.2 方法
• 1.2.1 含纤维二糖酶基因（BGL1）的重组质粒pYMIKP-BGL1的构建方法
• 1.2.2 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的搭建方法
• 1.2.3 酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法
• 1.2.4 固定化酵母细胞发酵方法
• 1.2.5 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 表达BGL1基因的重组菌株的构建结果
• 2.1.1 目的基因BGL1的获得
• 2.1.2 含目的基因BGL1重组质粒的构建
• 2.1.3 酿酒酵母工业菌株NAN-27转化子的获得
• 2.1.4 转化子NAN-28细胞纤维二糖酶活性测定结果
• 2.2 不同固定化条件对NAN-28细胞固定化的影响结果
• 2.2.1 不同溶剂对固定化细胞转化纤维二搪的测定结果
• 2.2.2 不同海藻酸钠浓度对固定化细胞凝胶特性的影响
• 2.2.3 酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖的影响结果
• 2.3 固定化细胞与游离细胞分批发酵实验结果
• 2.4 固定化细胞重复分批发酵试验结果
• 3 结论与讨论
• 3.1 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建
• 3.2 酿酒酵母工程菌细胞固定化
• 第七章 串联式生物反应器转化水稻秸秆生产燃料乙醇的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 稻草粉的预处理
• 1.2.2 纤维素酶的制备
• 1.2.3 稻草粉的酶解糖化
• 1.2.4 水稻秸秆生物转化燃料乙醇
• 1.2.5 测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同预处理方法对水稻秸秆糖化效果的影响结果
• 2.2 不同温度对水稻秸秆糖化效果的影响结果
• 2.3 不同pH对稻草粉糖化效果的影响结果
• 2.4 不同加酶量对稻草粉糖化效果的影响结果
• 2.5 不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果
• 2.6 水稻秸秆同步糖化发酵（SSF）结果
• 2.7 串联式反应器转化水稻秸秆生产乙醇
• 2.7.1 固定化NAN-28细胞发酵生产燃料乙醇结果
• 2.7.2 串联式生物反应器的稳定性结果
• 2.7.3 分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇结果
• 3 结论与讨论
• 3.1 二级串联式生物反应器生产乙醇
• 3.2 分批添料式协同酶解发酵工艺
• 3.3 水稻秸秆资源的全利用
• 第八章 结论
• 主要参考文献
• 英文缩写与主要符号表
• 本研究的特色与创新
• 发表与待发表的学术论文及成果
• 致谢
• 作者简介