论文摘要
5-氟尿嘧啶（5-Fu）和顺铂（DDP）是晚期胃癌化疗的关键药物,FP （5-Fu/DDP）是胃癌基本化疗方案。由于胃癌对化疗有天然的抗药性,单用化疗的疗效很有限。近年研究发现,化疗药与分子靶向药物联用可以提高化疗效果。曲妥珠单抗是一个以表皮生长因子受体2（HER-2/neu, HER2）为靶点的重组人源化单克隆抗体,单药及与化疗药联合治疗HER2阳性乳腺癌疗效确切,但对于胃癌的基础研究很少,结论也不一致,而有关的临床试验正在进行,尚未获得结果。本课题以胃癌细胞株为研究对象,检测了曲妥珠单抗联合5-Fu和/或DDP不同用药方案的抗瘤效应,探讨了药物相互作用的分子机制,最后结合乳腺癌的基础研究结果和临床用药经验,通过分析相关胃癌临床研究的试验设计思路,推导出曲妥珠单抗联合5-Fu和DDP治疗HER2阳性胃癌的最佳用药方案,为临床实践提供了一定的理论依据。本研究首先以HER2表达阳性的乳腺癌细胞株SK-BR-3为阳性对照,用流式细胞术对6株人胃癌细胞进行了HER2表达的鉴定。再用MTT法观察曲妥珠单抗、5-Fu和DDP单药及联合用药的抗瘤效应,比较药物对HER2阳性和阴性胃癌细胞作用的差异,确定曲妥珠单抗联合化疗药的最佳用药次序。然后以HER2阳性胃癌细胞株为研究对象,从以下3个方面对药物相互作用的分子机制进行探讨:1)采用流式细胞术（检测HER2蛋白）和Western Blot法（检测AKT、pAKT和NFκB蛋白）分析药物对HER2-PI3K-AKT信号转导的影响; 2)采用RT-PCR法分析药物对化疗药靶酶-胸苷酸合成酶（TS）和核苷酸切除修复交叉互补基因（ERCC1）mRNA的影响;3)采用流式细胞术分析药物对细胞周期的影响。实验结果如下:1.6株胃癌细胞株中,NCI-N87和YCC-2 HER2表达阳性,SGC7901、MGC803、BGC823和AGS的HER2表达阴性。2.曲妥珠单抗单用对HER2阳性及阴性的胃癌细胞均没有明显抑制作用,但可增强化疗药对HER2阳性细胞的毒性作用,其中,先5-Fu后曲妥珠单抗,先曲妥珠单抗和DDP联合再序贯使用曲妥珠单抗的方案效果最佳,但先曲妥珠单抗再和5-Fu联合可拮抗5-Fu的化疗效果。3.曲妥珠单抗可下调HER2蛋白水平,抑制AKT的磷酸化,但不影响核内NFκB的表达。5-Fu和DDP对pAKT和NFκB的表达没有影响,但与曲妥珠单抗联合时可抑制AKT的磷酸化。DDP与曲妥珠单抗同时使用对AKT磷酸化的抑制作用最强,并且能抑制NFκB的核移位。4.曲妥珠单抗可抑制ERCC1 mRNA的表达,不影响HER2 mRNA和TS mRNA的表达。5-Fu可抑制TS mRNA表达,但联用曲妥珠单抗没有使抑制作用进一步增强,DDP可上调ERCC1 mRNA表达,而联合曲妥珠单抗可使ERCC1 mRNA恢复至正常水平。5.曲妥珠单抗阻滞细胞在G0/G1期,减少S期细胞比例。5-Fu也阻滞细胞在G0/G1期,与曲妥珠单抗同时使用时S期细胞比例明显下降。DDP使大量细胞阻滞在S期,与曲妥珠单抗同时使用时G2/M期细胞比例接近零。分析以上结果得出结论如下:1.曲妥珠单抗能增强5-Fu和DDP对于HER2阳性胃癌的细胞毒性,且呈明显的方案依赖性。曲妥珠单抗对HER2-PI3K-AKT信号转导通路的抑制可能是其增效机制之一。2.曲妥珠单抗更适于与DDP联合用于HER2阳性胃癌的治疗,两药同时使用再序贯使用曲妥珠单抗的给药方法是最佳联合模式。曲妥珠单抗可能通过以下机制增强DDP的化疗效果:1)抑制AKT磷酸化,减少NFκB核移位,促进凋亡;2)下调ERCC1 mRNA表达,抑制DNA损伤修复;3)阻滞细胞于G0/G1期,减少G2/M期细胞,抑制细胞分裂,减少DNA修复机会。3.曲妥珠单抗与5-Fu联合应注意正确的用药次序,因为先曲妥珠单抗再和5-Fu联合可拮抗5-Fu的化疗效果。由于5-Fu是作用于S期的细胞周期特异性药,由曲妥珠单抗引起的S期细胞比例的减少可能会影响5-Fu化疗作用的发挥。4.曲妥珠单抗联合FP治疗HER2阳性胃癌的最佳用药方案为:曲妥珠单抗联合FP一定周期后,停止化疗,继续使用曲妥珠单抗直至进展。本研究的重要意义在于:1.曲妥珠单抗治疗乳腺癌已有10年的临床实践,我们首次针对胃癌细胞株,比较了曲妥珠单抗与化疗联合的不同用药次序对抗瘤效应的影响,并通过分子机制研究提供了合理解释。用药最佳方案的得出为相关药物联合治疗胃癌具有实际的临床指导意义。2.本研究首次将曲妥珠单抗与胃癌化疗核心药物5-Fu联合用于胃癌治疗,提出正确的用药次序是两药联合的基础,否则会造成拮抗,这在一定程度上否定了乳腺癌体外实验中两药拮抗的结论,为临床两药联合治疗胃癌提供了有力的理论支持。