论文摘要
研究背景:衰老是机体呈现的一种不同于成年机体的特殊生理状态,这种状态本身就增加了罹患疾病的风险。老年人群中缺血性心脏病的发病率和死亡率均远远高于成年人。虽然关于老年人冠状血管病变的发生机理已有大量研究,对老年人缺血性心脏病高发病率的成因也有一定的了解,但衰老心脏的心肌细胞对缺血性心脏病再灌注治疗的损伤敏感性增加而导致死亡率增高的机制仍然所知甚少。活性氮簇（Reactive Nitrogen Species,RNS）和细胞凋亡是近年来颇受重视的两个领域。但是,在衰老相关的心肌细胞凋亡中,RNS和凋亡信号之间相互作用的研究还处于初级阶段,许多基础的问题尚待解决。新近的研究发现,硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）可显著减少急性心肌缺血/再灌注小鼠心肌细胞凋亡;RNS的主要成员过氧亚硝基（ONOO-）可导致Trx氨基酸残基的硝基化修饰,从而降低其抗凋亡作用。我们的前期工作发现,衰老的心脏中RNS水平大大增高,但这种增高对Trx系统功能活动有什么影响,尤其是这种增高是否与衰老心脏对缺血/再灌注损伤的敏感性增高有关等,均未见文献报道。目的:1.观察衰老心脏心肌组织中Trx系统的功能及蛋白表达,及其在缺血/再灌注过程中的改变;2.探讨Trx系统硝基化修饰与衰老心脏及其缺血/再灌注后心功能之间的关系。方法:本研究选取成年（4-6月龄）及衰老（22-24月龄）的雄性SD大鼠,随机分为6组:正常成年组、正常衰老组、成年伪手术组、衰老伪手术组、成年缺血/再灌注组和衰老缺血/再灌注组。即,缺血/再灌注组均结扎大鼠左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时;伪手术组不结扎左冠状动脉前降支,其余操作同手术组。由于左室舒张功能指数与年龄有显著的相关性,左室舒张压（Left Ventricle Diastolic Pressure,LVDP）能较好的反映衰老心脏左室舒张期的充盈程度及心功能的状态,因此本研究同时在体监测各组LVDP的变化。以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Tunel terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick endlabeling,TUNEL）和特异性较强的半胱氨酸蛋白酶-3（Cysteinyl aspartate-specific protease-3,Caspase-3）活性测定法检测心肌细胞的凋亡程度,以胰岛素还原法测定心肌组织中Trx活性,以特异性较强的硫氧还蛋白还原酶（ThioredoxinReductase,TR）活性测定法测定心肌组织的TR活性,以Western Blot测定Trx、TR、硫氧还蛋白过氧化物酶（Thioredoxin Peroxydase,Tpx）以及硝基化硫氧还蛋白（Nitro-Trx）、硝基化硫氧还蛋白还原酶（Nitro-TR）、硝基化硫氧还蛋白过氧化物酶（Nitro-Tpx）的表达。结果1.Trx系统活性及表达的测定:1.1衰老大鼠心肌组织中Trx系统活性及表达均降低1.1.1 Trx系统活性降低采用胰岛素还原法和硫氧还蛋白还原酶测定试剂盒分别检测正常成年大鼠（n=5）和正常衰老大鼠（n=5）心肌组织Trx和TR的活性。与正常成年组相比,衰老大鼠心肌组织的Trx活性明显降低(2.6×10-5±0.4×10-5unit/ug prot vs.6.0x10-5±1.3×10-5unit/ug prot,P＜0.05)（图4）,TR活性明显降低(5.7×10-8±1.5×10-9unit/ug prot vs.9.4×10-8±1.0x10-9unit/ug prot,P＜0.01)（图5）。1.1.2 Trx系统表达降低为了进一步探讨Trx系统活性降低的原因是否与其表达的变化有关,本研究采用Western Blot的方法对正常成年大鼠（n=5）和正常衰老大鼠（n=5）的心肌组织中Trx和TR的表达进行检测。结果显示:与正常成年组相比,衰老大鼠心肌组织中Trx的表达明显降低（330.4+89.8 vs.500.8±116.5,P＜0.05）（图6）,TR的表达（1449.0±161.7 vs.1647.1±355.5）有所降低,无统计学差异,Tpx表达明显降低（520.1 vs.642.3,P＜0.05）（图7）。1.2缺血/再灌注衰老大鼠心肌组织中Trx系统活性进一步降低,表达无明显改变1.2.1 Trx系统活性降低采用胰岛素还原法和硫氧还蛋白还原酶测定试剂盒分别检测成年缺血/再灌注大鼠（n=8）和衰老缺血/再灌注大鼠（n=8）心肌组织Trx和TR的活性。各组大鼠Trx的活性较成年伪手术组大鼠(6.1×10-5±1.3×10-5unit/ug prot)明显下降。与成年缺血/再灌注组相比,衰老大鼠缺血/再灌注后心肌组织中Trx活性明显降低(0.7×10-5±0.4x10-5unit/ug prot vs.3.3×10-5±0.6x10-5unit/ug prot,P＜0.05)（图8）,TR活性明显降低(3.5×10-8±1.2×10-9unit/ug protvs.4.3×10-8±1.2×10-9unit/ug prot,P＜0.01)（图9）。1.2.2 Trx系统表达无明显改变采用Western blot的方法检测成年缺血/再灌注大鼠（n=8）和衰老缺血/再灌注大鼠（n=8）心肌组织中Trx、TR和Tpx的表达。与成年缺血/再灌注组比较,衰老大鼠缺血/再灌注后心肌组织中Trx表达降低不明显（173.5±90.3 vs.199.3±80.6）,TR表达有所降低（698.6±185.8vs.1158.4±496.1）,差异无统计学意义。2.心功能及心肌细胞凋亡测定2.1衰老大鼠左室舒张功能降低,心肌细胞凋亡增加2.1.1心功能降低采用颈动脉插管法对正常成年大鼠（n=4）和正常衰老大鼠（n=4）进行心功能监测。与正常成年组比较,正常衰老组大鼠LVDP明显升高（P＜0.05）（图10）。2.1.2细胞凋亡学检测2.1.2.1 TUNEL检测凋亡指数增高用原位细胞死亡检测试剂盒对正常成年大鼠（n=5）和正常衰老大鼠（n=5）的心肌细胞凋亡程度进行检测。结果表明,与正常成年大鼠相比,衰老大鼠的凋亡指数明显增高（3.143±0.428%vs 0.857±0.043%,P＜0.01）（图11,图12）。2.1.2.2 Caspase-3活性增高同时,我们配合特异性较强的caspase-3活性分析法检测正常成年大鼠（n=5）和正常衰老大鼠（n=5）心肌细胞的caspase-3活性。经测定,衰老大鼠心肌组织中caspase-3的活性为正常成年组的2.21±0.03倍（P＜0.05）（图13）。2.2缺血/再灌注衰老大鼠左室舒张功能进一步降低,心肌细胞凋亡进一步增加2.2.1心功能降低在心肌缺血/再灌注过程中,采用颈动脉插管法对成年大鼠（n=8）和衰老大鼠（n=8）进行心功能监测。与成年伪手术组大鼠相比,其他各组大鼠LVDP均明显升高。与成年缺血/再灌注组比较,衰老大鼠心肌缺血/再灌注时LVDP明显升高（P＜0.05）（图14）。2.2.2细胞凋亡学检测2.2.2.1 TUNEL检测凋亡指数增高用原位细胞死亡检测试剂盒分别对成年缺血/再灌注大鼠（n=8）和衰老缺血/再灌注大鼠（n=8）的心肌细胞凋亡程度进行检测。衰老缺血/再灌注大鼠组较成年缺血/再灌注大鼠组凋亡指数明显增高（10.24+0.08%vs 6.13+0.08%,P＜0.05）（图15,图16）,较衰老伪手术组也明显增高（10.244±0.08%vs.3.15±0.18%,P＜0.01）。2.2.2.2 Caspase-3活性增高采用caspase-3活性分析法对成年缺血/再灌注大鼠（n=5）和衰老缺血/再灌注大鼠（n=5）心肌组织的caspase-3活性进行检测。与成年缺血/再灌注组相比,衰老缺血/再灌注组大鼠心肌组织的caspase-3比活性增高（10.29±0.36 vs.8.55±0.29）,差异无统计学意义（图17）。2.3缺血/再灌注后心功能与Trx的活性呈正相关成年缺血/再灌注组大鼠及衰老缺血/再灌注组大鼠的心功能均与Trx活性呈正相关:LVDP与Trx活性呈负相关（r=-0.551,P＜0.05,n=9）（图18）,即随着Trx活性的增高,LVDP降低,也就是说Trx活性越高,缺血/再灌注后大鼠心脏舒张功能恢复得越好。提示:与成年缺血/再灌注组相比,衰老组大鼠缺血/再灌注后的心功能恢复较差可能与Trx活性的降低有关。3.Trx系统硝基化程度的测定3.1衰老大鼠心肌组织中Trx系统硝基化程度增高3.1.1 Nitro-Trx表达增高用Westem blot的方法测定正常成年大鼠（n=8）和正常衰老大鼠（n=8）心肌组织Nitro-Trx的表达。与正常成年组相比,衰老大鼠心肌组织中Nitro-Trx表达明显升高（0.86±0.10 vs0.56±0.02,P＜0.01）（图19）。3.1.2 Nitro-TR表达增高用Western blot的方法测定正常成年大鼠（n=8）和正常衰老大鼠（n=8）心肌组织Nitro-TR的表达。与正常成年组相比,衰老大鼠心肌组织中Nitro-TR表达明显升高（0.82±0.15 vs0.46±0.20,P＜0.05）（图20）。3.1.3 Nitro-Tpx表达增高用Western blot的方法测定正常成年大鼠（n=8）和正常衰老大鼠（n=8）心肌组织Nitro-Tpx的表达。与正常成年组相比,衰老大鼠心肌组织中Nitro-Tpx表达明显升高（0.48±0.07 vs0.33±0.03,P＜0.05）（图21）。3.2缺血/再灌注衰老大鼠心肌组织中Trx系统硝基化程度进一步增高3.2.1 Nitro-Trx表达增高用Western blot的方法测定成年缺血/再灌注大鼠（n=8）和衰老缺血/再灌注大鼠（n=8）心肌组织Nitro-Trx的表达。心肌缺血/再灌注后,各组大鼠Nitro-Trx的表达较成年伪手术组大鼠升高。与成年缺血/再灌注组比较,衰老大鼠缺血/再灌注后心肌组织中Nitro-Trx表达明显升高（0.84±0.16 vs.0.64±0.05,P＜0.05）（图22）。3.2.2 Nitro-TR表达增高。心肌缺血/再灌注后,各组大鼠Nitro-TR的表达较成年伪手术组大鼠升高。与成年缺血/再灌注组比较,衰老大鼠缺血/再灌注后心肌组织中Nitro-TR升高,差异无统计学意义。3.2.3 Nitro-Tpx表达增高心肌缺血/再灌注后,各组大鼠Nitro-Tpx的表达较成年伪手术组大鼠升高。与成年缺血/再灌注组（n=8）比较,衰老大鼠缺血/再灌注后（n=8）心肌组织中Nitro-Tpx表达明显升高（0.64±0.16 vs.0.47±0.11,P＜0.05）（图23）。3.3缺血/再灌注后心功能与Nitro-Trx的表达呈负相关成年及衰老缺血/再灌注组大鼠的心功能均与Nitro-Trx表达呈负相关:LVDP与Nitro-Trx的表达呈正相关（r=0.824,P＜0.05,n=9）（图24）。结论:1.衰老大鼠心肌组织Trx系统活性及表达降低,心肌缺血/再灌注后,Trx系统活性进一步降低,提示衰老心脏心功能降低以及对缺血/再灌注损伤敏感性升高可能与对心肌具有保护作用的Trx系统活性降低有一定的关联。2.心肌缺血/再灌注后,成年及衰老组大鼠的LVDP均与Trx的活性呈负相关,提示衰老大鼠心脏对缺血/再灌注损伤敏感性升高与Trx系统活性的降低密切相关。3.衰老大鼠心肌组织中Trx系统的硝基化程度增高,心肌缺血/再灌注后,Trx系统的硝基化程度进一步增高,提示衰老大鼠心肌缺血/再灌注后Trx系统活性及表达的降低,对心脏保护作用的减弱,可能与其硝基化程度的增高有关。4.缺血/再灌注后,成年及衰老组大鼠的LVDP均与Trx的硝基化程度呈正相关,提示衰老大鼠对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性升高与Trx系统硝基化程度的增高密切相关。