玉米自交系幼胚转化体系建立及DWF4基因的农杆菌介导转化

论文摘要

玉米是重要的粮饲兼用作物,对于我国经济和社会发展具有重要意义。玉米的遗传改良是生物技术育种和种质创新的重要途径。本研究以齐319、昌7-2、178、18-599玉米自交系幼胚为试材,系统研究了幼胚遗传转化受体系统建立和农杆菌介导影响因素,并运用农杆菌介导方法将油菜素类酯生物合成相关酶基因DWF4进行遗传转化,获得了转基因植株。主要研究结论如下:1、幼胚受体系统建立研究发现,在外植体雌穗授粉后1015天,取长度为1.6 mm的幼胚,2425℃盾片向上培养,胚性愈伤不但得率最高,而且质量较好,最适宜做转化受体;在诱导培养基中添加“2,4-D(3.0 mg L-1)+NAA(0.2 mg L-1)”可以显著增加胚性愈伤组织的形成,其中,齐319出愈率能达到100%,昌7-2、178出愈率可以达到85%和35%;筛选剂巴龙霉素的愈伤浓度分别确定,齐319三轮筛选的PRM浓度依次为80、120和80 mg L-1,18-599为90、120和90 mg L-1,昌7-2为55、100和55 mg L-1。2、在农杆菌浸染时,容易控制浸染过程的菌液浓度和浸染时间组合为“菌液浓度（OD600=0.4）和浸染时间（10 min）”;“培养基+滤纸”的共培养方式也可以很好地降低浸染过度率。3、对得到的31株转基因植株进行PCR和RT-PCR检测,得到3株阳性植株,阳性植株率为12.9%,转化率为0.26%。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 玉米遗传转化研究进展
• 1.1.1 转基因受体系统
• 1.1.2 愈伤组织再生系统
• 1.1.3 原生质体再生系统
• 1.1.4 种质系统
• 1.1.5 直接分化再生系统
• 1.2 遗传转化方法
• 1.2.1 基因枪法
• 1.2.2 农杆菌介导法
• 1.2.2.1 原理与应用
• 1.2.2.2 影响因素
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.2.4 其它转化方法
• 1.3 玉米转基因技术的应用
• 1.4 油菜素内酯研究进展
• 1.4.1 油菜素内酯的发现、结构和生物合成途径
• 1.4.2 油菜素内酯的生理效应
• 1.4.3 生物合成及相关突变体
• 1.4.3.1 生物合成途径
• 1.4.3.2 油菜素内酯合成中相关的突变体
• 1.4.3.3 BR 生物合成的调节
• 1.4.3.3.1 反馈调节
• 1.4.3.3.2 光调节
• 1.4.4 信号传导及其相关突变体
• 1.4.4.1 信号传导
• 1.4.4.2 信号途径中突变体
• 1.4.4.3 BR 相关基因工程
• 1.4.5 DWAF4 基因
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 受体材料
• 2.1.2 菌种、质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.2 常用培养基和溶液的配制
• 2.2.1 YEB 培养基
• 2.2.2 基本培养基
• 2.2.3 常用溶液配制
• 2.2.4 试验所需试剂及溶液配制
• 2.2.4.1 质粒DNA 的提取
• 2.2.4.2 植物基因组DNA SDS 法提取缓冲液
• 2.2.4.3 植物总RNA 提取
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 受体系统建立和优化
• 2.3.1.1 幼胚长度筛选
• 2.3.1.2 盾片朝向
• 2.3.1.3 组培温度
• 2.3.2 浸染和筛选
• 2.3.2.1 农杆菌培养和浸染菌液浓度
• 2.3.2.2 筛选剂巴龙霉素筛选浓度确定
• 2.3.2.3 浸染
• 2.3.2.4 筛选
• 2.3.3 分化和炼苗移栽
• 2.3.4 转化苗的PCR 检测
• 2.3.5 RT-PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 幼胚受体系统的建立
• 3.1.1 幼胚长度对愈伤诱导的影响
• 3.1.2 培养基组分（2,4-D 和NAA）比对幼胚出愈率的影响
• 3.1.3 继代次数对幼胚出愈率的影响
• 3.1.4 组培温度对幼胚日均膨大率和出愈率的影响
• 3.1.5 盾片朝向对诱导愈伤的影响
• 3.1.6 筛选剂巴龙霉素筛选浓度的确定
• 3.2 农杆菌浸染过程控制
• 3.2.1 农杆菌适宜浸染浓度的确定
• 3.2.2 共培养方式对过度浸染率的影响
• 3.3 转基因植株的分子检测
• 3.3.1 转化植株的PCR 检测
• 3.3.2 转化植株的RT-PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 玉米受体系统的建立与优化
• 4.2 愈伤筛选
• 4.3 转化植株分化、移栽
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 硕士学位论文内容简介及自评