转化雪莲PEBP基因陆地棉株系的筛选和抗寒效果的研究

论文摘要

新疆雪莲（Saussurea involucrata Kar.et Kir）为新疆珍稀物种,能耐受严酷的生长环境,特别是具有很强的抗寒能力。雪莲PEBP基因是本实验室分离出的新抗寒基因,共有510个核苷酸,网上进行BLAST对比,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的磷脂酞乙醇胺结合蛋白基因类似,相似性81%。雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding family protein,PEBP）基因表达产物与细胞膜的冷稳定性有关,可能在植物抗寒方面起一定作用。本研究以新疆陆地棉为材料。采用花粉管通道法进行转基因研究,到目前为止,外源DNA导入途径由花粉管通道法派生发展出了注射法和干种子浸泡法。在我们的研究中采用了注射法,以对新疆棉花子进行了转化。对转基因后代进行除草剂筛选和PCR鉴定,并采用Southern blot技术对转基因植物纯系SiPEBP进行了分析。结果表明。除草剂基因及雪莲PEBP基因已经整合到陆地棉基因组中。植株进行标记基因表达和分子生物学检测,获得转抗寒基因的棉花植株直接利用大田和室温低温实验对转抗寒基因的棉花植株的抗寒表现进行分级鉴定。为今后进一步研究雪莲PEBP基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 低温胁迫对植物的伤害
• 1.1 冻害与冻害的生理
• 1.1.1 结冰伤害的类型及其原因
• 1.1.2 结冰伤害的机理
• 1.2 冷害与冷害生理
• 1.2.1 冷害表现
• 1.2.2 冷害伤害的机理
• 2. 植物抗寒的分子基础
• 2.1 膜稳定性相关基因
• 2.2 植物的冷诱导墓因
• 2.3 抗冻蛋白
• 2.3.1 抗冻蛋白的生化特性
• 2.3.2 动物抗冻蛋白及其转基因植物
• 2.3.3 植物抗冻蛋白研究的现状与趋势
• 3. 花粉管通道转基因技术
• 4. 本论文研究意义
• 5. 本论文创新之处
• 第二章 花粉管通道法介导的棉花遗传转化
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 目的基因
• 1.1.2 供试材料
• 1.1.3 质粒和菌株
• 1.1.4 生化试剂
• 1.1.5 仪器
• 1.1.6 实验所配试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PC3301-SIPEBP和PCHF3- SIPEBP质粒DNA的大量提取
• 1.2.2 质粒DNA的纯化
• 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）
• 1.2.4 细胞转化
• 1.2.5 平板培养（有时需要稀释）
• 1.2.6 PC3301-SIPEBP和PCHF3- SIPEBP质粒DNA的酶切鉴定
• 1.2.7 花粉管通道法介导SIPEBP转化棉花植株
• 1.2.8 转化SIPEBP基因陆地棉株系的筛选
• 2. 结果与分析
• 2.1 利用花粉管通道转化技术获得纯系
• 2.2 转基因棉花纯系筛选
• 3 讨论
• 第三章 SOUTHERN BLOT杂交分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 棉花基因组提取所用溶液
• 1.3 棉花基因组提取所用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 棉花基因组DNA的提取
• 2.2 酶切基因组DNA
• 2.3 电泳
• 2.4 转膜
• 2.5 标记探针（PRIME-A-GENE LABELING KIT，PROMEGA）
• 2.6 探针标记后的检测
• 2.8 预杂交
• 2.9 杂交
• 2.10 洗膜、染色及检测
• 2.11 检测
• 2.12 冲洗胶片
• 3 结果与分析
• 第四章 转S IPEBP基因棉花的抗寒性鉴定
• 一、 大田抗寒实验
• 二、 温室抗寒实验
• 第五章 结论与展望
• 1. 结论
• 1.1 利用花粉管通道转化技术获得转基因棉花株系
• 1.2 SOUTHERN BLOT杂交分析
• 1.3 转SIPEBP基因棉花的抗寒性鉴定
• 1.3.1 大田抗寒实验
• 1.3.2 温室抗寒实验
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢