论文题目: 产河豚毒素菌株RG-3B6、RG-33B的分离纯化及其发酵产物中河豚毒素的检测
论文类型: 博士论文
论文专业: 生理学
作者: 武振龙
导师: 夏国良,张荣庆
关键词: 河豚毒素,产河豚毒素菌,达松维尔拟诺卡放线菌,梭形芽孢杆菌,红鳍东方豚
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种剧毒的生物碱类天然神经毒素,最初是从豚科鱼的卵巢和肝脏中提取得到的。TTX为典型的Na+通道阻断剂,它能够与肌肉、神经细胞膜上钠离子通道受体结合,抑制动作电位的传导。TTX除用作神经生理学、肌肉生理学的工具药外,还具有相当强的镇痛作用,并极有可能成为新的局部麻醉药和戒除药物依赖性的药物,而且具有不成瘾的特点,这就使TTX的应用范围得到进一步扩展。目前市场上的TTX主要来源于河豚鱼的卵巢和肝脏组织,如果能经微生物发酵生产TTX,不仅可以满足市场的需求,而且对于保护河豚鱼免受因河豚毒素的开发而濒危灭绝有着重要的生态价值。 关于TTX的起源问题一直存在较多争议。从首次从河豚鱼体内分离到TTX以后的很长一段时间内,人们一直认为TTX是河豚鱼自身分泌产生的生物毒素,虽然进行了大量的组织学研究,但在河豚鱼体内并未找到分泌TTX的腺体和导管。研究发现,TTX还广泛分布于河豚鱼之外多种脊椎动物及无脊椎动物的体内或体表。TTX在与河豚鱼无亲缘关系和食物链关系的多种动物体内的发现,使得TTX的起源问题引起研究者的广泛兴趣与关注。尽管研究者已从多种海洋细菌的发酵产物中检测TTX及其类似物,但都没有真正获得微生物来源的TTX的结晶,因此无法从结构与功能上系统地研究和确证其与组织来源的TTX的完全一致性。已经证实,河豚鱼的卵巢和肝脏的毒性高于河豚鱼其它组织与器官,而这种毒性的差异是否与不同组织中的产TTX菌的分布及产TTX能力的不同有关,尚无文献报道。 本论文以采集于我国渤海的红鳍东方豚为研究对象,对其不同组织器官中的微生物进行分离纯化,并对其中两株产TTX的优良菌RG-33B、RG-3B6进行了种属鉴定,对其发酵产物中的TTX进行分离与纯化,并将生物检测与化学检测相结合,对微生物源TTX的结构和生物学功能进行了研究。结果表明:(1)河豚鱼的卵巢、肝脏、肠道中存在可产生TTX的细菌与放线菌,河豚鱼不同组织毒性的差异与其中产TTX菌株的产毒能力有关;(2)培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析表明,RG-33B为达松维尔拟诺卡氏放线菌,RG-3B6为梭形芽孢杆菌,其中达松维尔拟诺卡氏菌发酵产生TTX的报道在国际上尚属首次;(3)获得微生物源的TTX,并从结构和生物学功能的角度证实,微生物发酵产生的TTX与河豚鱼组织中的TTX是一致的,这一结果为TTX的微生物起源假说提供了有力的实验依据。 总之,本论文首次对河豚鱼体内产TTX菌的分布、微生物源TTX的分离与纯化进行了研究,获得微生物源的TTX,并从结构和功能上证实其与组织来源的TTX相一致,为通过微生物发酵生产TTX提供了一种新思路,同时也为TTX的微生物起源假说奠定了坚实的实验基础。
论文目录:
摘要
Abstract
目录
英文缩写中文对照
第一篇 文献综述
第一章 河豚毒素的结构及生物学功能
1 河豚毒素(TTX)的发现
2 TTX的化学结构
3 TTX的理化性质
4 TTX的作用机理及生物学功能
4．1 TTX中毒
4．2 TTX中毒的防治措施
4．3 TTX作用机理
4．4 TTX在生物医学上的应用
5 河豚鱼的TTX耐受与TTX结合蛋白
6 TTX的分离纯化
第二章 TTX检测方法研究进展
1 生物检测法
1．1 小鼠生物检测法
1．2 动作电位法
1．3 竞争取代法
1．4 组织培养法
1．5 其它生物检测法
2 化学检测法
2．1 荧光分光光度计法
2．2 紫外分光光度计法
2．3 高效液相色谱法
2．4 薄层层析法
2．5 醋酸纤维膜电泳法
2．6 毛细管电泳法
2．7 气相色谱-质谱联用技术
2．8 薄层色谱法-快原子轰击质谱法
2．9 免疫化学检测
第三章 TTX的分布与起源
1 TTX在生物体内的分布
1．1 TTX在河豚鱼体内的分布
1．2 TTX在其它生物体内的分布
2 TTX的起源
3 本论文的研究意义
4 本论文的研究内容
第二篇 实验研究
第四章 产TTX菌株的分离纯化
1 材料
1．1 试验动物与细胞系
1．2 试剂
1．3 主要仪器
1．4 常用溶液及培养基配制
2 方法
2．1 样品的采集
2．2 菌种的分离和保藏方法
2．3 小鼠生物检测法的建立
2．4 河豚鱼组织中TTX检测
2．5 发醉产物中毒亲的检测
3 结果
3．1 小鼠生物检测法的建立
3．2 河豚鱼组织中的TTX含量测定
3．3 组织培养法的建立
3．4 细菌发酵产物中TTX检测
4 讨论
第五章 产 TTX菌株 RG-33B、RG-3B6分类鉴定
1 材料
1．1 菌株
1．2 试剂
1．3 主要仪器
1．4 常用溶液及培养基配制
2 方法
2．1 细菌形态学观察
2．2 菌落形态观察
2．3 细胞壁类型分析
2．4 生长温度范围、PH及 NaCl耐受实验
2．5 硝酸盐还原实验
2．6 明胶液化实验
2．7 氛化酶实验
2．8 淀粉水解能力测定
2．9 碳源的利用
2．10 降解活性实验
2．11 G+Cmol%的测定
2．12 16S rDNA序列测定
2．13 生长曲线测定
3 结果
3．1 RG-3B6菌株种属鉴定结果
3．2 RG-33B菌株种属鉴定结果
4 讨论
第六章 微生物源 TTX的分离纯化与结构及生物学功能确证
1 材料
1．1 菌株及细胞系
1．2 试剂
1．3 主要仪器
2 方法
2．1 微生物源 TTX分离与纯化
2．2 微生物源 TTX结构及功能确证
3 结果
3．1 微生物源 TTX的分离纯化
3．2 微生物源 TTX结构和功能确证
4 讨论
第七章 TTX多克隆抗体的制备
1 材料
1．1 试剂
1．2 主要仪器
1．3 溶液的配制
2 方法
2．1 抗原制备
2．2 动物免疫
2．3 双向免疫扩散试验
2．4 抗血清的收集与分离
2．5 酶联免疫吸咐法测定抗血清的效价
2．6 抗体的纯化
2．7 TTX多克隆抗体的毒素中和效应
3 结果与讨论
3．1 TTX多克隆抗体的制备
3．2 TTX多克隆抗体性质初步研究
第八章 结论
参考文献
致谢
个人简介
博士期间已发表和待发表的论文
发布时间: 2005-07-18
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