麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究

论文摘要

小麦在我国是重要的粮食作物,在深加工方面的重要途径是生产小麦淀粉和谷朊粉等。近年来,由于谷朊粉的产量不断增加,传统的市场趋于饱和。从普通小麦中提取麦醇溶蛋白和麦谷蛋白,应用于食品及非食品方面的深加工,在世界范围引起极大的关注。根据谷朊粉及麦谷蛋白有着特殊的氨基酸组成即高谷氨酰胺含量,所以本文以提取的麦谷蛋白为酶解底物生产谷氨酰胺肽并进行动物实验验证其营养效果。1.以谷朊粉为原料,运用正交组合设计对麦谷蛋白的提取工艺进行了优化研究。经单因素及正交试验得出提取麦谷蛋白的最佳条件为pH值12,料液比1:20,时间1h。并且经柱层析及DSC分析证明了提取的麦谷蛋白产品具有很高的纯度,并分析了麦谷蛋白的变性温度为67.41℃2.以麦谷蛋白为酶解底物,以酶解物谷氨酰胺肽的含量为指标,从三种商业蛋白酶中筛选出胰蛋白酶和碱性蛋白酶进行双酶分步酶解,制备谷氨酰胺肽。确定了Gln活性肽的水解用酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶。通过两次酶解工艺制备Gln活性肽,最佳的酶解组合是先用胰蛋白酶提高蛋白的溶解度,然后碱性蛋白短时间内酶解从而达到最佳的酶解效果,结合SAS软件分析结果表明胰蛋白酶酶解条件温度47.6℃,底物浓度2.79%,酶与底物质量比13mg/g。碱性蛋白酶的条件温度68℃、底物浓度3%、酶与底物质量比30μl/g、pH8.0、和反应时间1.5h。酶解液通过透析（10000以下）后产品有效Gln为213.5mg/g。3.经凝胶层析的方法对谷氨酰胺肽进行了分离和纯化,通过GPC分析了各组分的分子量的分布,通过高效液相和质谱分析表明:经凝胶柱分离的单一组分仍然是由分子量不同的许多肽组成的混合物,其分子量主要分布在1000-800D左右。质谱分析组分得到一级和二级质谱图,并根据一级和二级质谱图分析多肽的氨基酸组成。4.用氨甲蝶呤诱发小肠炎后,分别饲喂Gln含量不等的氨基酸营养液,结果表明,氨甲蝶呤诱发的小肠炎是一种较严重的应激状态,在72h内,空白组大鼠的死亡率为42.9%,对照组的死亡率为16.7%,其它测定指标也相对低于低剂量和高剂量组,并且低剂量和高剂量组死亡率为零,酶活、DNA和RNA含量增加,这说明,谷胺酰胺活性肽营养液对小肠具有明显的营养作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1.1 谷朊粉的研究进展
• 1.2 麦谷蛋白的研究进展
• 1.2.1 麦谷蛋白理化性质研究
• 1.2.2 麦谷蛋白酶解产物的研究
• 1.3 谷氨酰胺的研究进展
• 1.3.1 谷氨酰胺的生理作用
• 1.3.2 谷氨酰胺对肠道的作用
• 1.4 蛋白酶的研究
• 1.5 本课题研究的意义、目的和内容
• 1.5.1 本课题研究的意义和目的
• 1.5.2 本课题的研究内容
• 第二部分 麦谷蛋白提取及工艺的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 方法
• 2.1.3.1 麦谷蛋白的提取方法
• 2.1.3.2 蛋白质含量的测定
• 2.1.3.3 水份含量的测定
• 2.1.3.4 总灰分的测定
• 2.1.3.5 粗脂肪的测定
• 2.1.3.6 蛋白质提取率的测定
• 2.1.3.7 柱层析
• 2.1.3.8 变性温度测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 麦谷蛋白的主要成分
• 2.2.2 提取条件对蛋白质提取率的影响
• 2.2.2.1 pH对提取率的影响
• 2.2.2.2 提取时间对提取率的影响
• 2.2.2.3 液固比对提取率的影响
• 2.2.3 麦谷蛋白提取工艺的优化
• 2.2.4 G-100洗脱曲线
• 2.2.5 差示扫描量热
• 2.3 结论
• 第三部分 麦谷蛋白制备谷氨酰胺（Gln）活性肽
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白酶的活力测定
• 3.2.2 水解度（DH）的测定
• 3.2.3 可溶性蛋白质的测定
• 3.2.3.1 标准蛋白质溶液
• 3.2.3.2 双缩脲试剂
• 3.2.3.3 标准曲线的测定
• 3.2.4 小麦蛋白的溶解度的测定
• 3.2.5 样品肽的制取
• 3.2.6 肽或蛋白中Gln含量的测定
• 3.2.6.1 Gln残基转化
• 3.2.6.2 酸水解
• 3.2.6.3 PITC衍生
• 3.2.6.4 检测条件及进样量
• 3.2.6.5 溶剂及洗脱梯度
• 3.2.6.6 标准溶液的配置
• 3.2.7 最佳酶解条件优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶活力测定的标准曲线
• 3.3.2 可溶性蛋白质的测定的标准曲线
• 3.3.3 蛋白酶的酶活力测定结果
• 3.3.4 谷氨酰胺峰的确定
• 3.3.5 水解用酶及酶解条件的确定
• 3.3.5.1 单一蛋白酶酶解麦谷蛋白谷氨酰胺的产率
• 3.3.5.2 单一蛋酶白酶解麦谷蛋白水解度的影响
• 3.3.6 不同条件对胰蛋白酶酶解反应的影响
• 3.3.6.1 不同温度对胰蛋白酶酶解反应的影响
• 3.3.6.2 不同底物浓度对胰蛋白酶酶解反应的影响
• 3.3.6.3 不同加酶量对胰蛋白酶酶解反应的影响
• 3.3.7 响应面分析酶解优化条件及实验结果
• 3.3.7.1 双因素交互作用分析
• 3.3.7.2 各因素对DH%的重要性分析
• 3.3.8 二次酶解谷氨酰胺肽产率及水解度变化
• 3.4 结论与讨论
• 第四部分 谷氨酰胺肽分离、纯化和结构初探
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 方法
• 4.1.3.1 标准洗脱曲线的测定
• 4.1.3.2 氨基酸检测
• 4.1.3.3 HPLC-MS分析Gln肽的结构
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 谷氨酰胺肽的凝胶过滤色谱分析
• 4.2.1.1 凝胶层析标准物质洗脱曲线
• 4.2.1.2 凝胶柱分离及分析谷氨酰胺肽分子量的分布
• 4.2.1.3 GPC分析各组分的分子量分布
• 4.2.2 谷氨酰胺肽氨基酸分析
• 4.2.3 HPLC分析峰Ⅳ的组成成分
• 4.2.4 质谱分析谷氨酰胺肽的结构
• 4.3 结论与讨论
• 第五部分 谷氨酰胺活性肽营养液对肠道的营养作用
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.1.4 实验动物
• 5.1.5 实验方法
• 5.1.5.1 饲养方式
• 5.1.5.2 饲养条件
• 5.1.5.3 给药途径及给药量
• 5.1.6 数据处理
• 5.1.7 指标分析
• 5.1.7.1 死亡率
• 5.1.7.2 粘膜蛋白含量的测定
• 5.1.7.3 粘膜DNA和RNA含量的测定
• 5.1.7.4 还原糖含量的测定
• 5.1.7.5 双糖酶活力的测定
• 5.1.7.6 氨肽酶的活力测定
• 5.2 实验结果与讨论
• 5.3 结论
• 第六部分 结论及讨论
• 参考文献
• 致谢