pthA-NLS转化糖橙获得抗溃疡病种质及椪柑转chit42基因的研究

论文摘要

柑橘在世界农业经济中占有重要地位,但其产业发展一直受到柑橘各种病害的制约。栽培措施与农药对柑橘病害的防治能力有限,且化学农药还会造成严重的环境污染,抗病育种成为解决柑橘病害的必然选择。柑橘常规育种受到育种周期长、珠心胚干扰、性器官败育、遗传上高度杂合等因素影响而进程缓慢,同时物种间生殖隔离亦阻碍了常规育种进程。转基因技术的应用与抗病相关基因的克隆为柑橘抗病育种提供了新的思路。本研究采用农杆菌介导法,以柑橘溃疡病致病基因pthA的核定位信号（NLS）和抗真菌病害基因chit42为外源目的基因,分别将其转入到糖橙和椪柑中,通过嫁接使抗性芽再生成苗。采用PCR和RT-PCR等技术对转基因材料进行鉴定分析;通过离体接种病菌实验对转基因植株的抗病能力进行评价。主要研究结果如下:1.构建了PBI121-NLS植物表达载体;用农杆菌介导法将pthA-NLS基因导入到糖橙中,并经PCR,RT-PCR和Southern blot杂交分析获得9个转基因株系;转基因植株叶片离体接种柑橘溃疡病菌,结果表明转基因植株对柑橘溃疡病菌有很强的抗性。2.建立了椪柑实生苗上胚轴节间茎段的离体再生体系,结果表明:茎段在MS基本培养基中的萌芽率最高,可以达到83.3%,且萌芽时间短,多为单芽,芽体健壮,嫁接成活率高;抗生素筛选试验表明卡拉霉素（Km）100mg/l时可以有效控制逃逸体和嵌合体的产生;将抗性芽通过嫁接成苗,取新叶提取DNA,通过PCR初步鉴定,18株抗性植株中有3株为转基因植株。3.采用了7种消毒方法对椪柑成年态节间茎段消毒,结果表明“改良消毒法”可有效降低其污染率和死亡率,分别可降至12.2%和27.2%;椪柑成年态节间茎段在MS+1mg/l BA+0.5 mg/l NAA中的不定芽萌芽率最高,达12.8%:选用5 mm以下的茎尖可明显提高嫁接成活率,不过,使用1 mm左右茎尖进行微芽嫁接嫁接成活率最高,这可能与柑橘接穗越大携带的内生菌越多有关。通过农杆菌介导法将目的基因chit42转入到椪柑中,获得12棵抗性芽,PCR初步检测表明获得1棵转基因植株。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 问题的提出
• 2 柑橘转基因研究进展
• 2.1 品种及外植体
• 2.2 外源目的基因
• 2.2.1 报告标记基因和选择基因
• 2.2.2 柑橘品质及性状相关的外源基因
• 2.2.3 柑橘早花基因
• 2.2.4 高柑橘抗逆性的基因
• 2.2.5 其他基因
• 2.2.6 柑橘抗病基因工程研究进展
• 2.2.6.1 植物抗病性的机制
• 2.2.6.2 抗病基因工程在柑橘上的应用
• 2.3 转化方法
• 2.3.1 影响转化率的因素
• 2.3.1.1 基因型
• 2.3.1.2 外植体
• 2.3.1.3 农杆菌菌株
• 2.3.1.4 转化过程
• 3 功能基因介绍
• 3.1 几丁质酶基因
• 3.2 pthA-NLS基因
• 4 本研究的目的及意义
• 第二章 pthA-NLS基因植物表达载体构建及转化糖橙获得抗病新种质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 pthA-NLS基因植物表达载体构建
• 1.2.1 核定位信号（NLS）序列的扩增、克隆和测序
• 1.2.2 pthA-NLS转化农杆菌
• 1.2.2.1 农杆菌EHA105感受态制备
• 1.2.2.2 冻融法转化农杆菌EHA105
• 1.3 pthA-NLS对甜橙的遗传转化
• 1.3.1 受体材料的获得
• 1.3.2 对照材料芽的诱导
• 1.3.3 外植体转化处理
• 1.3.4 抗性芽的诱导
• 1.3.5 不定芽茎尖嫁接成苗
• 1.3.6 室二次嫁接
• 1.4 转pthA-NLS基因糖橙的PCR鉴定
• 1.4.1 基因组DNA的提取
• 1.4.2 转化再生植株的PCR检测
• 1.5 转pthA-NLS基因糖橙外源基因RT-PCR表达分析
• 1.5.1 RNA的提取
• 1.5.2 RT-PCR反应
• 1.6 转pthA-NLS基因糖橙外源基因southern杂交分析
• 1.6.1 总DNA提取
• 1.6.2 探针的制备
• 1.6.3 总DNA的限制酶消化
• 1.6.4 转膜
• 1.6.5 紫外交联
• 1.6.5 预杂交和杂交
• 1.6.6 沈膜
• 1.6.7 显影
• 1.7 转基因植株抗性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 NLS序列的克隆
• 2.2 NLS序列植物表达载体的构建
• 2.3 pthA-NLS对糖橙的遗传转化结果
• 2.4 转pthA-NLS基因糖橙外源基因pthA-NLS表达分析
• 2.4.1 总RNA提取
• 2.4.2 外源基因pthA-NLS表达分析
• 2.5 转pthA-NLS糖橙外源基因southern杂交分析
• 2.3 转PBI-NLS植株抗性试验
• 3 讨论
• 第三章 椪柑实生态离体再生体系的建立及转chit42基因的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实生苗上胚轴材料的获得
• 1.2 主要的生化试剂及仪器
• 1.3 农杆菌菌株与质粒
• 1.4 主要培养基配方
• 1.5 农杆菌的活化和工程菌液的制备
• 1.6 桠柑节间茎段诱导不定芽再生
• 1.7 抗生素浓度筛选
• 1.8 外植体的转化
• 1.9 抗性芽的嫁接
• 1.10 PCR检测
• 1.10.1 椪柑植株DNA的提取
• 1.10.2 基因组DNA提取步骤
• 1.10.3 PCR分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 椪柑不定芽的诱导
• 2.2 BA和NAA对不定芽的影响
• 2.3 抗生素浓度的选择
• 2.4 PCR检测
• 3 讨论
• 第四章 椪柑成年态节间茎段再生体系的建立及转Chit42基因的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 成年态材料的获得
• 1.2 主要的生化试剂及仪器
• 1.3 农杆菌菌株与质粒
• 1.4 方法
• 1.2.1 成年态节间茎段消毒方法
• 1.2.2 统计方法
• 1.2.3 成年态椪柑节间茎段再生培养条件
• 1.2.4 成年态椪柑节间茎段转化
• 1.2.5 不定芽再生成苗
• 1.2.6 抗性植株PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 不同消毒方法的灭菌效果
• 2.2 不同激素浓度和配比对节间茎段再生的影响
• 2.3 成年态接穗大小对嫁接成活率的影响
• 2.4 PCR分子检测
• 3 讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历