PRB与PIAS3的相互作用及其功能研究

论文摘要

孕激素是一种甾体类激素,在细胞生长、增殖功能中发挥重要作用。孕激素功能的发挥主要通过激素与细胞内特异的孕激素受体相互作用而产生,而孕激素受体PR主要有两种亚型,即孕激素受体PRA和PRB。孕激素受体是一个结构相似基因家族-核受体亚家族的成员,这个家族的蛋白都是配基激活转录调节子。孕激素受体这两种亚型的不同主要在于PRB在其N端的BUS区包含一段164个氨基酸的AF3区。一般来说,PRB存在于细胞浆中,在孕激素作用下,PRB会进入细胞核发挥其转录活性。 PR和其他核受体的转录活性与蛋白的转录后共价修饰有关,它会影响到蛋白质的结构和蛋白质与蛋白质之间的相互作用。这些修饰包括蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化。其中SUMO化与共价结合SUMO（small ubiauitin-like modifier protein）蛋白有关。一些重要的转录因子,比如GR、AR、P53、c-Jun和c-Myc都与SUMO-1共价结合。与泛素化一样,SUMO化有一组激活酶-E1、E2、E3酶,SUMO化修饰会引起蛋白质亚细胞定位、稳定性或者是基因的转录活性的改变。 本文结果显示,我们在用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察PRB的亚细胞定位时发现,在PIAS3的存在下,即使加入孕激素,也有大部分PRB并不进入细胞核。这提示在PRB与PIAS3之间可能存在某种功能上的相互作用。因此,我们在人胚胎肾细胞293T中建立了一套PRB转录激活荧光报告测试系统,检测到PIAS3对PRB转录激活活性有很强的抑制作用,并且这种抑制作用是孕激素依赖的。为了验证PRB与PIAS3之间是否可以相互结合,我们将PRB与PIAS3构建到酵母表达载体上。实验证明PRB与PIAS3在酵母细胞中可以相互结合,并且我们找出PRB与PIAS3相互作用的区域主要是PRB的DBD结构域。 为进一步确认PRB与PIAS3之间存在特异性的蛋白质相互作用,本文进行了体外结合实验（in vitro: GST pull-down）和体内结合实验（in vivo: IP）,并获得了与酵母中的发现相一致的实验结果。除此之外,本文还应用激光扫描共聚焦

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株、质粒
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 细胞培养试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞转染
• 2.2 PRB亚细胞定位的观察
• 2.3 荧光素酶活性测定
• 2.4 PRB的转录活性的测定
• 结果与讨论
• 1.PRB亚细胞定位的观察
• 2.PRB转录激活测试系统的建立
• 3.PIAS3抑制外源PRB的转录活性
• 4.PIAS3对PRB转录活性的抑制依赖孕激素
• 小结
• 第二部分 酵母双杂交技术验证PIAS3与PRB的相互作用
• 材料与方法
• 1 材料及来源
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 PRB酵母表达载体的构建
• 2.2 PIAS3酵母表达载体的构建
• 2.3 PCR扩增目的片段
• 2.4 酶切PCR产物和载体
• 2.5 连接
• 2.6 大肠杆菌的转化
• 2.7 质粒提取、酶切片段的鉴定
• 2.8 Western blot分析
• 2.9 酵母细胞的转化
• 结果与讨论
• 1.酵母表达载体的构建及鉴定
• 2.PRB各种缺失突变体在酵母细胞中的表达鉴定
• 3.PIAS3在酵母细胞中自身转录激活活性的测定
• 4.PRB及缺失突变体在酵母细胞里与PIAS3的结合
• 小结
• 第三部分 PRB与PIAS3相互作用的进一步验证
• 材料与方法
• 1 试剂、材料及仪器
• 1.1 质粒、菌株、细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 细胞培养试剂
• 1.4 抗体
• 1.5 大型仪器
• 2 方法
• 2.1 GST融合表达载体的构建
• 2.2 COS7、293T细胞瞬时转染
• 2.3 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.4 GST沉淀（pull-down）分析
• 2.5 免疫共沉淀
• 2.6 亚细胞定位分析
• 结果与讨论
• 1.GST表达载体的构建及鉴定
• 2.GST融合蛋白的表达鉴定及其纯化
• 3.PRB与PIAS3相互作用的验证
• 3.1 PRB与PIAS3在体外的相互作用
• 3.2 PRB与PIAS3在体内的相互作用
• 3.3 PRB与PIAS3在活细胞内的相互作用
• 小结
• 第四部分 PIAS3抑制PRB活性的机制
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株、质粒
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 PRB的SUMO化点突变体的构建
• 2 方法
• 2.1 细胞转染
• 2.2 荧光素酶活性测定
• 2.3 Western blot分析
• 结果与讨论
• 1.PIAS3对PRB及其点突变体转录激活活性的影响
• 2.PRB SUMO化的western分析
• 3.PRB点突变体SUMO化的western分析
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 英文缩略词
• 文章发表与交流