山葡萄CBF低温反应途径相关基因的克隆及植物表达载体的构建

论文摘要

拟南芥CBF（CRT/DRE binding factor）转录因子在冷应答途径中具有重要作用,一个CBF转录因子能激活下游众多与抗逆有关的功能基因的表达。虽然植物中存在多条冷应答途径,但目前对CBF途径的研究最为深入,功能最确切,所以CBF基因家族是植物抗寒分子育种的首选目标。本文利用PCR技术首次从山葡萄（Vitis amurensis）中分离并克隆了两个新的CBF基因（基因银行注册号码为DQ517297和DQ517298）,分别命名为VaCBF2和VaCBF3;同时,构建了两基因的植物表达载体。主要研究结果如下:1.通过将GenBank上发表的几种植物的CBF同源基因进行比较在其保守区域设计一对兼并引物,采用PCR方法从山葡萄cDNA中获得两个大小分别为536bp和527bp的CBF基因中间片段,并进行了克隆,测序。2.在两中间片段区域分别设计了两对特异引物,采用反向PCR方法对山葡萄CBF基因的5’和3’端的非编码区进行克隆,结果分别得到两长度约1200bp和1000bp的片段。与中间片段拼接后预测基因全长区域。3.在预测的全长区域的非编码区分别设计一对特异引物对山葡萄基因组进行扩增,分别得到954bp和885bp的片段。经测序证实得到的序列即为CBF基因全长,分别命名为VaCBF2和VaCBF3。4.应用DNAMAN软件将VaCBF2和VaCBF3全长与Genebank上发表的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比较,结果发现VaCBF2和VaCBF3均具有AP2保守区和CBF家族的一系列特征,这说明我们已经成功地克隆了VaCBF2和VaCBF3。5.利用半定量RT-PCR方法对VaCBF2和VaCBF3进行表达分析。6.利用Gateway技术构建了VaCBF2和VaCBF3植物表达载体,将这两个表达载体转入农杆菌EHA0105中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 植物抗寒基因工程研究进展
• 1.2 CBF转录因子研究概况
• 1.3 本实验研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 山葡萄CBF低温反应途径相关基因中间片段的分离
• 3.2 反向PCR分离山葡萄CBF低温反应途径相关基因的旁侧序列
• 3.3 山葡萄CBF低温反应途径相关基因全长DNA的克隆
• 3.4 山葡萄CBF低温反应途径相关基因的序列分析
• 3.5 山葡萄CBF低温反应途径相关基因的表达量分析
• 3.6 山葡萄CBF低温反应途径相关基因表达载体的构建及转化农杆菌
• 第四章 讨论
• 4.1 山葡萄CBF2和CBF3序列特性的分析
• 4.2 山葡萄CBF2和CBF3表达特性的分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介