论文摘要
胃癌是全球范围内第二位致患者死亡的恶性肿瘤,胃癌细胞的远处转移是导致患者死亡的主要原因,已成为目前临床胃癌治疗的主要障碍。肿瘤细胞向远处转移是一个受多因素调控、涉及多基因、需要经历一系列连续的、可选择的级联事件,其过程理论上包括脱离原发瘤灶、迁移运动、局部浸润、血管生成、渗入脉管系统、在循环系统中存活、渗出脉管系统和在远隔的转移部位再生长。在胃癌的转移级联反应事件过程中,胃癌细胞的黏附、侵袭、运动和迁移等步骤所涉及的各种相关因素正逐渐被认识。然而胃癌细胞的远处转移是一个极其复杂的过程,研究表明有多种基因、酶类及细胞因子等参与调控促进或抑制胃癌细胞的转移,但至今胃癌细胞发生转移的确切分子机制仍未充分阐明,因而积极探讨、研究及至阐明胃癌细胞转移的确切分子机制,将会对临床胃癌的防治和预后产生深远影响。MicroRNAs是一类内源性的、非编码的、单链的、序列高度保守的小分子RNA,可在转录后水平负性调控靶基因的表达,几乎参与生命活动过程中的每一个生物学事件。越来越多的研究表明microRNAs与肿瘤关系密切,它不仅调控肿瘤细胞增殖凋亡,而且参与调控肿瘤细胞转移。最近有相当数量的microRNAs经研究证实参与调控肿瘤细胞转移的分子机制,如miR -10b、miR-21、miR-126、miR-335、miR-373、miR-146、miR-520c和miR-205参与调控乳腺癌细胞的转移机制;miR-224和miR-21参与调控前列腺癌细胞的转移;miR-29c可以抑制鼻咽癌细胞转移;异常表达的miR-182可以促进黑色素瘤细胞的转移;miR -21可以促进结肠癌细胞的转移;miR-10a、miR-222、miR-125b、miR-7和miR-452参与调控膀胱上皮癌的转移机制;miR-218通过调控Robo1受体抑制胃癌细胞的转移。鉴于目前胃癌高转移性所导致的危害及其转移机制尚不明确的现状,是否还有其他microRNAs参与调控胃癌细胞转移的分子机制值得进一步探讨和研究。本课题采用microRNAs芯片技术检测、比较胃癌患者的原发瘤和转移瘤组织中microRNAs的表达谱,初步筛选出在转移瘤组织中差异低表达的microRNAs,然后通过生物信息学功能预测及Realtime PCR定量检测其在胃癌组织中的表达量,筛选出与人胃癌细胞转移抑制可能相关的microRNAs,进而在细胞水平通过CCK-8细胞增殖实验和Transwell细胞侵袭实验进行相关功能鉴定,以期发现新的具有抑制调控人胃癌细胞转移功能的microRNAs,从而有助于揭示胃癌细胞转移的分子机制及探寻临床抗胃癌转移治疗的新靶点,并进一步丰富microRNAs的生物学功能。第一部分人胃癌转移抑制相关的microRNAs的筛选目的:通过检测胃癌患者的转移瘤和原发瘤组织中microRNAs表达谱,初步筛选出在人胃癌转移瘤组织中差异低表达的microRNAs。方法:采用microRNAs芯片技术检测3例胃癌患者的转移瘤和原发瘤组织中microRNAs的表达谱,以在3例人胃癌转移瘤组织中均呈低表达（≤0.67and>0）状态为标准进行筛选。结果:microRNAs芯片检测显示hsa-miR-508-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR -30c、hsa-miR-483-5p和hsa-miR-134在3例胃癌患者转移瘤组织中均表达下调（≤0.67 and>0）。结论:1.胃癌患者转移瘤组织和原发瘤组织的microRNAs表达谱存在差异;2. hsa-miR-508-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-30c、hsa-miR-483-5p和hsa-miR-134在胃癌患者转移瘤组织中下调表达,可能与胃癌细胞转移抑制机制相关。第二部分候选microRNAs生物信息学功能预测及定量分析目的:通过对候选microRNAs进行生物信息学预测其潜在的靶基因、靶蛋白以及其相应的信号传导通路,同时扩大样本量定量检测其在人胃癌原发瘤和转移瘤组织中的表达,筛选出在胃癌患者的转移瘤组织中显著低表达的、可能具有胃癌细胞转移抑制功能的microRNAs。方法:使用TargetScan数据库以及上海其明生物信息科技有限公司自主开发的microRNAs预测引擎预测候选microRNAs的潜在靶基因及靶蛋白,采用fisher精确检验计算显著性功能及其信号传导通路,构建候选microRNAs及其靶基因、靶蛋白的调控网络图;同时运用Realtime PCR方法检测候选microRNAs在16例胃癌患者的原发瘤和转移瘤组织中的表达量。结果:1.生物信息学功能预测提示hsa-miR-30c、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-337-3p和hsa- miR-134具有调控肿瘤细胞转移的潜在靶基因、靶蛋白及其相应的信号传导通路。2. Realtime PCR定量检测显示在胃癌患者的转移瘤组织中hsa-miR-337-3p和hsa- miR-134的表达较原发瘤显著下调（P<0.05）。结论: hsa-miR-134和hsa-miR-337-3p在胃癌患者的转移瘤组织中下调表达,可能参与抑制调控胃癌细胞转移的分子机制。第三部分候选microRNAs对人胃癌细胞株增殖与转移的影响目的:在细胞水平研究hsa-miR-337-3p和hsa-miR-134对人胃癌细胞增殖和转移的影响。方法:采用Real-time PCR技术检测hsa-miR-134和hsa-miR-337-3p在多种人胃癌细胞株中的表达水平;应用hsa-miR-337-3p和hsa-miR-134抑制剂及模拟剂转染人胃癌细胞株MKN-45,通过CCK-8细胞增殖实验和Transwell细胞侵袭实验观察其对人胃癌细胞株MKN-45的增殖和转移的影响。结果:1.与GES细胞相比, hsa-miR-134在SNU-5、AGS、HGC-27、MGC-803、MKN-28和MKN-45中的表达上调,而在SNU-1中表达下调;hsa-miR-337-3p在胃癌细胞中表达下调,仅在SNU-5、HGC27和SGC-7901中检测到hsa-miR-337-3p微量表达,其余胃癌细胞系均未检测到表达;2.细胞增殖实验显示hsa-miR-134或hsa-miR-337-3p的高表达对人胃癌细胞株MKN-45增殖的影响与对照组相比均无显著差异;3.细胞侵袭实验显示hsa-miR-134的表达对人胃癌细胞株MKN-45的转移能力的影响与对照组相比无显著差异;而hsa-miR-337-3p的模拟物转染MKN-45细胞后,可显著抑制人胃癌细胞株MKN-45的转移。结论:hsa-miR-337-3p在体外具有抑制人胃癌细胞转移的功能。
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