论文摘要
过氯酸铵（Ammonium Perchlorate, AP）是过氯酸盐类的一种,具有强氧化性,其作为固体推进剂已广泛应用于航天及国防工业中,同时也用于烟火制造等民用方面,因而存在着AP职业性接触及危害。有研究报道,AP对动物甲状腺具有明显的毒作用,干扰甲状腺功能的内稳态。研究已表明：AP是甲状腺滤泡上皮细胞上钠碘转运体（NIS）的碘离子的强效抑制剂。目前,已知AP通过竞争性抑制NIS,抑制甲状腺摄取碘,从而扰乱动物的下丘脑-垂体-甲状腺轴的内稳态。但利用人正常甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori3-1）,在体外探讨AP的氧化损伤机制及对细胞因子合成影响的相关报道较少。AP是如何影响甲状腺滤泡上皮细胞基底膜上NIS表达,AP如何调控碘离子氧化合成有机碘的甲状腺过氧化物酶（TPO）的活性,以及不同剂量AP染毒对合成甲状腺激素的甲状腺球蛋白（Tg）表达水平调控的机制,目前仍不清楚。环境暴露水平AP是否对人体的甲状腺功能产生健康影响,在国际范围仍认识不一,国外学者认为人体存在健全的甲状腺代偿性保护机制,血清甲状腺功能指标不是指示暴露情况的特异性生物标志物,目前可得到的证据还不能证实甲状腺激素水平的变化和过氯酸盐环境暴露之间的因果关系。已知AP进入体内不经代谢从尿中排出,我们通过染毒动物模型也发现,大鼠尿液中AP随着暴露剂量的增加而呈剂量反应性增加,故通过测定尿中AP水平能很好地评价其暴露情况。以前的研究选取血清甲状腺功能参数作为评价暴露的指标,仅作为效应标志物是非特异性的,无法精确反映暴露剂量与其变化的趋势。如何选择敏感、特异的生物标志物评价作业工人的暴露水平是当务之急。因此,为深入研究AP对甲状腺的毒作用机制,探讨选择合适的内负荷指标,本课题分别从细胞体外实验、染毒动物模型建立及作业人群职业卫生调查三个方面,来研究AP对甲状腺细胞氧化损伤机制及特异性蛋白表达、血清甲状腺功能参数的影响,并评价尿中AP作为职业暴露人群生物标志物的有效性,以期能选择合适的内负荷指标,对职业暴露的作业工人进行早期的健康监护,为保护工人健康和预防控制其可能产生的职业危害提供科学方法和参考依据。第一部分过氯酸铵对甲状腺细胞毒作用机制的研究目的：研究AP对人甲状腺细胞（Nthy-ori3-1）氧化应激及诱导凋亡的影响,同时探讨AP对甲状腺细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量及对特异性蛋白NIS、Tg、TPO及cAMP蛋白水平表达的的影响。方法：体外培养Nthy-ori3-1细胞,接触不同浓度AP （0、5、10、20、40mmol/L）及KI（5.25mmol/L）联合染毒后置37℃,5%CO2培养24h,CCK8法检测Nthy-ori3-1细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧（ROS）,同时测定氧化损伤指标丙二醛（MDA）及过氧化氢酶（CAT）活力；收集细胞上清液,采用ELISA试剂盒,上酶标仪测定吸光度值,根据标准曲线进行定量；收集细胞裂解后提取蛋白,采用Western blotting测定甲状腺细胞特异蛋白NIS、Tg、TPO及cAMP蛋白水平的变化。结果：AP抑制Nthy-ori3-1细胞增殖具有明显的剂量依赖性。与对照组相比,各组细胞内ROS生成量随着染毒剂量的增加出现降低趋势,除5mmol/L AP剂量组外,差异均有统计学意义（P<0.05）；较高剂量AP染毒（40mmol/L）甲状腺细胞,MDA生成量比对照组有明显升高,差异有统计学意义（P<0.001）；各染毒剂量组细胞内CAT活力比对照组有升高的趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）；高AP剂量组IL-1β水平比低剂量组明显下降（P<0.05）；AP中、高剂量组及AP高碘组（40mmol/L AP+25mmol/L KI）的IL-6水平比对照组明显降低（P<0.01）；AP高剂量组、AP低碘组（40mmol/L AP+5mmol/L KI）及AP高碘组（40mmol/L AP+25mmol/L KI）的TNF-α水平比对照组明显下降（P<0.01）；与对照组（0.758）相比,低、中、高AP染毒剂量组Tg水平分别为0.563、0.484、0.211,呈现明显降低趋势（P<0.05）；低、中、高AP染毒剂量组TPO表达水平分别为0.521、0.489、0.246,随着染毒剂量增加而明显降低（P<0.05）；而NIS、cAMP表达水平随染毒剂量增加无明显变化（P>0.05）。结论：AP可致Nthy-ori3-1细胞出现氧化应激,诱导细胞凋亡,细胞内ROS量随着染毒剂量的增加而降低,且二者之间存在明显的剂量反应关系。当染毒AP浓度为40mmol/L时,对甲状腺细胞明显产生氧化损伤作用,碘在一定程度上可缓解AP对甲状腺细胞的氧化应激反应；AP染毒Nthy-ori3-1细胞可随着染毒剂量的增加,细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）生成量降低的趋势越明显,这可能是细胞自身负反馈调节机制在发挥作用；AP可通过抑制特异性转录因子表达水平从而引起Tg、TPO蛋白表达水平下调,从细胞层面再次验证AP可抑制甲状腺激素合成的关键蛋白的表达水平,从而直接干扰甲状腺激素的合成过程。第二部分过氯酸铵对作业人群甲状腺功能的影响目的：了解AP粉尘职业性危害对作业工人健康的影响,为其预防措施提供科学依据。方法：选择该厂接触AP粉尘的51名作业工人为接触组,不接触AP粉尘的41人为对照组。调查工厂的一般情况,监测作业场所的AP粉尘浓度,对两组人群进行职业体检,检测血常规、肝肾功能、甲状腺激素、尿碘含量,进行肺通气功能检查,同时对职业接触史等基本情况进行健康调查问卷。结果：粉尘是AP作业场所最主要的职业性有害因素,本次调查各生产车间粉尘浓度均较低,以烘干过筛、称量车间最高,均为1.175mg/m3;复分解车间最低,为0.425mg/m3。体检结果显示,两组人群经比较,接触组血压舒张压（69.67mmHg）明显低于对照组（79.02mmHg）（P<0.05）;接触组工人气短症状的检出率（9.80%）明显高于对照组（0%）（P<0.05）；接触组工人尿素氮（BUN）（5.27U/L）明显高于对照组（4.30U/L）,差异有统计学意义（P<0.01）,但二者均在正常参考值范围内而无临床意义；接触组的TT4（65.61ng/ml）水平明显低于对照组（81.88ng/ml）, TSH（3.75mIU/L）明显高于对照组（2.68mIU/L）,差异均有统计学意义（P<0.05）；接触组血清FT4（11.67fmol/ml）也低于对照组（13.14fmol/ml）,但其差异尚不显著。结论：接触组工人的血清FT4、TT4水平比对照组降低,而TSH则比对照组升高,可能是接触AP所致,提示长期接触AP粉尘可能会对作业工人甲状腺功能造成不良影响。第三部分过氯酸铵接触的生物标志物研究目的：建立敏感、特异、快速测定生物材料中AP含量的方法,为AP职业人群进行早期生物监测提供科学依据。方法：利用严格控制染毒剂量的大鼠尿液标本进行预实验,对测定方法的各测量参数进行初步探索；采集接触组与对照组工人的生物材料（血、尿样）,采用简单稀释的样品前处理方法,同时利用同位素内标技术消除基质效应,运用已初步建立的超高效液相色谱质谱/质谱法（1JHPLC-MS/MS）,对两组人群生物材料中AP进行定量分析及评价。结果：AP经口饮水染毒在0～520mg/kg/day剂量范围内,大鼠尿中AP含量水平与染毒剂量存在明显相关关系（R2=0.8342）,回归方程为Y=5.5222X+291.17。方法的准确度及精密度分别为91.7～99.61%、3.37～7.08%；接触组工人血、尿中AP含量的平均值分别为2.463、12.82μg/L,中位数分别为2.59、4.89μg/L;对照组工人血、尿中AP含量平均值分别为1.00、9.10μg/L,中位数分别为0.83、3.56μg/L。接触组工人血、尿中AP含量与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：尿中AP水平可作为其暴露的有效生物标志物。相比于尿液,血中AP指示环境暴露更为敏感、特异,但样本不易取得,在人群生物监测中应用有其难度。采集特定人群尿样对其过氯酸盐含量进行测定不失为评价环境暴露的优选方法。