布朗葡萄藻烃成分分析，培养条件优化及不同时期的形态结构比较

论文摘要

布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）,又名葡萄藻,从粒藻,产烃量通常为25%40%,大大高于其它微生物的产烃量,有望成为无污染可再生的石油替代能源。葡萄藻的产烃量易受藻株,培养条件,生长时期等因素影响而表现出一定的差异性。就目前的研究来看,限制葡萄藻实际应用的主要因素是不能短时间内获得高的生物量,因此优化葡萄藻的培养条件以提高生长速率、实现高密度培养,从而提高其产烃量是十分关键的;此外,关于葡萄藻不同时期形态结构变化方面也未见有详细报道。本研究对葡萄藻（FACHB 357）的烃成分进行分析,并针对氮源及其它几个影响葡萄藻生长的主要因子进行培养条件优化,同时研究了葡萄藻不同生长时期显微及超微结构的详细变化,主要方法及结果如下:1、葡萄藻的烃成分分析对葡萄藻的总脂及总烃含量进行测定,并利用气相色谱-质谱仪进行分析,该藻株总脂和总烃含量分别占生物干重的34.9%,30.7%;烃化合物包括正构烷烃,异构烷烃,及相对量较高的烯烃,根据烃性质认为该藻株属于化学种B。2、葡萄藻培养氮源的选择选取三种常规氮源,KNO3,NaNO2,NH4Cl,分别利用单因素分析法进行实验,通过OD680的值来反映葡萄藻生物量。每两天测一次,培养32天,以生物量为判断标准,葡萄藻对KNO3的适合浓度范围是18mM,最佳浓度是2mM,其OD680最大值为0.184,平均生长率是0.0417;,对NaNO2的适合浓度范围是16mM,最佳浓度是2mM,OD680最大值为0.169,平均生长率是0.0361;对NH4Cl的适合浓度范围是0.51mM,最佳浓度是0.5mM,OD680最大值是0.1140,平均生长率0.0160。比较发现, NH4Cl不利于藻体生物量的积累,硝酸钾优于NaNO2,鉴于培养条件的交互效应,KNO3的浓度需进一步优化。3、葡萄藻主要培养条件的整体优化根据已有文献,影响葡萄藻生长的主要培养条件是碳源,氮源,磷源,温度（T）,光强（P）,所用的碳源,氮源,磷源分别是NaHCO3,KNO3,K2HPO4。针对这5个因子,以生物量为响应值,进行两水平的全因子实验设计并结合响应曲面法对实验设计进行优化。析因表明,5个因子的选择对生物量影响都是有效的,影响强弱依此为:T> K2HPO4>P> KNO3> NaHCO3,其中,温度,K2HPO4,光强、NaHCO3为正效应,KNO3为负效应。主因子/交叉因子的分析结果是KNO3,K2HPO4,T,P,T*NaHCO3是显著性的,NaHCO3为非显著性的。最终的优化条件是NaHCO3,0.21g/L;KNO3,0.525g/L;K2HPO4,0.105g/L,光强3750lux,T,24°C。其与改良Chu13培养基有较大差别,需进一步实验验证。4、不同时期藻体细胞的显微超微结构比较为了解布朗葡萄藻不同生长阶段形态结构的变化,应用光学显微镜和透射电镜对不同时期的藻体进行观察。光镜观察发现,培养过程中藻细胞颜色由绿色变为浅黄色,粘连藻细胞的无色透明胶质部分变为橙红色,呈半透明状态;藻集落存在先增大后缩小的过程,稳定期部分集结体解体,游离出具连续细胞外壁的单细胞。电镜研究不同生长阶段藻细胞超微结构变化发现,细胞外壁层数有先增加后减少的趋势;对数期含烃颗粒分布最多;叶绿体由伸展状态逐渐收缩,类囊体带排列从指纹状变为条索状,淀粉粒在培养后期大量积累;相对延滞期,核体积增大;不同阶段线粒体脊的形态和排列方式有差异;液泡个数和体积显著增加;高尔基体在对数期数量较多,体积较大,并常观察到伸展膨胀的潴泡;细胞质基质逐渐趋向无序化。根据不同时期藻体形态结构的差异,对藻体颜色,烃含量,藻集落及细胞外壁层数的变化进行了解释,同时也对葡萄藻的繁殖及分类作了进一步探讨。本研究将为葡萄藻（FACHB 357）的进一步研究积累基础资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 0 引言
• 1 发展可再生能源-生物质能的必要性和可行性
• 1.1 世界石油危机和全球环境变化
• 1.2 生物质能的特点
• 1.3 国内外生物质能的实际发展状况
• 2 微藻生物质可再生能源的开发利用
• 2.1 微藻生物质的优点
• 2.2 生烃的藻类
• 3 葡萄藻的研究概况
• 3.1 葡萄藻的发现和研究意义
• 3.2 葡萄藻的形态学以及分类学研究
• 3.3 葡萄藻的生化物
• 3.4 葡萄藻的培养，烃回收，烃基因克隆
• 4 试验条件优化常用的方法
• 5 立题依据及研究意义
• 第二章 布朗葡萄藻烃成分的初步分析
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种与培养
• 1.2 设备与仪器
• 1.3 测定方法
• 2 结果
• 2.1 藻体的总脂，总烃含量及烃成分初步分析
• 3 讨论
• 3.1 藻株的烃含量及成分分析
• 3.2 藻株所属化学种
• 第三章 布朗葡萄藻生长的最适氮源选择及主要培养条件优化
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种与培养
• 1.2 设备与仪器
• 1.3 培养方法
• 1.4 测定方法
• 2 结果
• 680 的关系'>2.1 藻细胞干重与 OD₆₈₀的关系
• 2.2 不同氮源及浓度对藻体生长的影响
• 2.3 主要培养条件的优化
• 3 讨论
• 680 的关系'>3.1 藻细胞干重与 OD₆₈₀的关系
• 3.2 不同氮源对葡萄藻生长的影响
• 3.3 优化条件中的氮源，磷源
• 3.4 优化条件中的碳源浓度
• 3.5 优化条件中的光强
• 3.6 化条件中的温度
• 第四章 布朗葡萄藻不同生长阶段的显微及超微结构变化
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种来源
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 形态特征研究方法
• 2 结果
• 2.1 布朗葡萄藻的光学显微结构
• 2.2 葡萄藻的超微结构
• 3 讨论
• 3.1 不同生长阶段藻体形态结构的变化
• 3.2 葡萄藻繁殖及分类地位探讨
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况