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重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析

2020-11-22阅读(719)

重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析

论文摘要

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群,并且其某些基因型与生物体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要海水经济养殖鱼类真鲷、大菱鲆和牙鲆为实验材料,利用PCR、RT-PCR、RACE、Southern blot等技术研究了MHCⅡ基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系,为筛选抗病相关MHCⅡB基因标记,建立基因标记辅助选育技术提供基础。（1）根据本实验室建立的真鲷cDNA文库中EST序列测序,得到全长为1191bp的MHCⅡBcDNA序列（Genbank accession NO.: AY848956）,经BLAST分析为MHCⅡB基因。和其它脊椎动物的全长基因组序列比较,设计特异性引物进行内含子的PCR扩增,得到2494bp的基因组全序列。以rsbMHC2bIn1N和rsbMHC2bIn4C为引物进行PCR扩增,扩增产物包括完整开放阅读框序列,有7个真鲷个体被用于分析真鲷MHCⅡB的多态性,结果得到6个不同的等位基因。为了研究真鲷MHCⅡB的位点数量,用同一对引物对同一真鲷个体的开放阅读框的cDNA序列进行了PCR扩增。在所测序的11个不同的阳性克隆中,有4个不同的cDNA序列被鉴定出。另外,利用rsbMHC2b3’UTRN和rsbMHC2b3’UTRC为引物,扩增同一真鲷个体的3’UTR,有12个阳性克隆被测序,测序结果中有2个不同的序列被鉴定出,表明MHCⅡB基因至少存在两种不同的位点。用Southern blot方法进一步验证真鲷MHCⅡB基因的位点数。用MEGA3.0构建系统进化树,结果发现真鲷MHCⅡB基因的7种不同的序列聚类到一簇,另外与鲈鱼的亲缘关系较近,与丽鱼、虹鳟、大西洋鲑的亲缘关系次之,与小鼠和人类的最远。以正常鱼和鳗弧菌感染后真鲷组织为材料,以反转录合成的第一链cDNA为模板,应用RT-PCR半定量检测方法对真鲷的MHCⅡB基因组织表达特点进行了研究,结果表明,在正常真鲷组织中,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、肾、胃、小肠和心脏中,在肌肉和血中表达最弱。在鳗弧菌感染后的肝脏、脾脏、小肠和头肾组织中,卡方检验表明,MHCⅡB基因表现为具有极显著差异的表达（χ2=103.79,248.19,19.44和87.38,P<0.01）。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 前言
  • 第一节 鱼类的免疫系统
  • 1 鱼类的免疫器官
  • 2 细胞免疫
  • 3 体液免疫因子
  • 4 鱼类的免疫应答及其调节
  • 第二节 水生动物的育种技术
  • 1 选择育种
  • 2 引种驯化
  • 3 杂交选育
  • 4 染色体组倍性育种
  • 5 细胞工程育种
  • 6 基因工程育种
  • 7 DNA 标记辅助育种
  • 第三节 鱼类抗病相关基因的研究进展
  • 1 抗菌肽
  • 2天然抗性相关巨噬蛋白
  • 3 NK 细胞增强因子
  • 4主要组织相容性复合体
  • 4.1 MHC 基因家族的分类
  • 4.2 MHC 基因的结构特征
  • 4.3 MHC 基因的功能
  • 4.4 MHC 分子的遗传特性
  • 4.5 MHC 基因的表达调控
  • 第四节 论文的研究目的和意义
  • 第二章 真鲷MHCⅡB基因的克隆、表达和多态性分析
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 真鲷MHCⅡB 基因组DNA 序列的克隆和序列分析
  • 2.2 真鲷 MHCⅡB 氨基酸序列的多态性和系统进化树分析
  • 2.2.1 真鲷MHCⅡB 氨基酸序列的序列多态性分析
  • 2.2.2 用Southern杂交检测真鲷MHCⅡB基因的位点数
  • 2.2.3 真鲷 MHCⅡB 序列的进化树分析
  • 2.3 用RT-PCR 检测真鲷MHCⅡB 基因的表达
  • 3 讨论
  • 3.1 真鲷 MHCⅡB 基因的序列特征
  • 3.2 真鲷 MHCⅡB 基因的表达分析
  • 3.3 基因拷贝数和位点数目的检测
  • 第三章 大菱鲆 MHCⅡ基因的克隆、表达和多态性分析
  • 0 引言
  • 1 材料和方法
  • 2结果与分析
  • 2.1 大菱鲆 MHCⅡ基因的克隆
  • 2.2 大菱鲆 MHCⅡ基因序列和结构分析
  • 2.3 大菱鲆 MHCⅡ基因的的同源性和系统发生分析
  • 2.4 大菱鲆MHCⅡB 基因的多态性分析
  • 2.5 MHCⅡ基因的表达
  • 3 讨论
  • 3.1 大菱鲆 MHCII 基因的序列和结构分析
  • 3.2 大菱鲆 MHCⅡ基因氨基酸序列中密码子的偏爱
  • 3.3 大菱鲆 MHCⅡ基因的表达
  • 第四章 牙鲆MHCII 基因的研究
  • 第一节 牙鲆 MHCII 基因的克隆和表达分析
  • 0 引言
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 牙鲆 MHCⅡ基因的克隆
  • 2.2 牙鲆MHC Ⅱ基因的序列、同源性和系统发生分析
  • 2.3 牙鲆MHCⅡ基因的表达
  • 3 讨论
  • 3.1 牙鲆MHCII 基因的快速扩增和序列的结构特征
  • 3.2 MHC 基因的多态性
  • 3.3 MHC 基因的表达
  • 第二节 牙鲆MHCⅡB 基因的多态性及多态性与鱼体抗病力的相关关系的分析
  • 0 引言
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 牙鲆MHCⅡB 基因多态性分析
  • 2.2 牙鲆MHC ⅡB等位基因的多态性与抗病力的关系
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间完成的论文
  • 致谢

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