DLL1基因在小鼠B16黑色素瘤形成中的作用研究

论文摘要

Notch信号通路是进化上高度保守的细胞与细胞间的信号传导系统,通过调控细胞的分化、增殖、凋亡的命运选择,在胚胎正常发育、机体稳态调控以及成体干细胞的维持中发挥重要作用。在胚胎血管发育过程中,Notch信号通路调控着动静脉血管的分化和血管内皮Tip细胞和Stalk细胞的命运选择,对胚胎血管网络正常结构和功能的维持起到了关键作用。Notch信号通路调控的异常往往由于血管网络发育的缺陷而导致胚胎死亡。在成体生理性新生血管形成中,Notch信号通路的激活限制了血管的过度生成,维持了机体的稳定。在肿瘤血管中,DLL4的表达显著增高,阻断DLL4激活的Notch信号通路引起了肿瘤血管的无功能性过度生成,使肿瘤的血流灌注减少而抑制了肿瘤的生长;而过表达DLL4虽然肿瘤血管的生成,但却改善了肿瘤血管的结构和灌流功能,促进了肿瘤的生长。但与此同时,也有研究证实Notch的另一配体Jagged1能通过促进肿瘤的功能血管的形成而促进肿瘤的生长。鉴于Notch信号通路的调控作用环境依赖性（Context-dependent）和Notch分子间的功能特异性,我们检测了另外一个Notch配体DLL1在肿瘤血管中的作用。DLL1调控胚胎期动静脉血管的分化和成体损伤后血管的形成。但其在肿瘤血管中的作用还没有详细的研究报道。我们在DLL1与肿瘤血管的研究中主要做了以下工作:1、构建共表达DLL1蛋白和绿色荧光蛋白（GFP）的真核表达质粒。通过设计特异引物,利用PCR方法扩增出DLL1基因片段,测序正确后连接通过到pIRES2-EGFP质粒中;然后对新构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒进行了酶切鉴定和测序。2、在体外实验中发现DLL1的表达促进肿瘤细胞的体外增殖。通过分别转染pIRES2-EGFP-DLL1质粒和pIRES2-EGFP质粒,药物筛选建立了稳定表达DLL1基因和GFP基因的B16黑色素瘤细胞系;检测发现DLL1激活了肿瘤细胞Notch信号通路;MTT和软琼脂克隆形成实验表明DLL1的表达促进了肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。3、观查到DLL1通过减少肿瘤血管的生成抑制了肿瘤在小鼠体内的生长。小鼠皮下荷瘤实验发现实验组肿瘤在小鼠体内的生长长受到抑制,基因检测发现Notch通路在肿瘤中激活,免疫荧光和免疫组化实验证实血管肿瘤中血管形成减少,肿瘤组织血供障碍,缺氧程度加重,坏死增加。结论:综上所述,我们的研究认为DLL1在肿瘤细胞中的表达能通过肿瘤细胞间的相互作用激活HES1、HEY1等Notch下游基因,促进肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。但在B16-DLL1肿瘤在小鼠体内的生长并没有相应的加速,反而受到了抑制。可能原因是肿瘤的快速增殖需要与营养的供应相适应,而DLL1的表达一方面促进了肿瘤细胞的增殖,另一方面却使肿瘤血管的生成减少,结构紊乱,扰乱了肿瘤的血液供应,加重了肿瘤内部缺血缺氧情况,使肿瘤组织坏死增加,从而抑制了肿瘤的生长。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、Notch 信号通路
• 二、Notch 信号通路对血管形成的作用
• 三、Notch 在肿瘤血管中的作用
• 五、Notch 信号通路与黑色素瘤生长的关系
• 实验一 载体的构建
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 菌株、质粒和工具酶
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要工作试剂配制
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 目的基因的扩增
• 2.3 目的基因表达载体构建
• 3 实验结果
• 3.1 D1、D2 基因片段的PCR扩增
• 3.2 D1、D2 PCR片段的测序
• 3.2 pIRES2-EGFP-DLL1 质粒的鉴定和测序
• 讨论
• 实验二 DLL1 基因在小鼠黑色素瘤细胞中的表达及功能
• 1 材料与仪器
• 1.1 细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.5 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞转染
• 2.2 DLL1 在细胞中表达的鉴定
• 2.3 细胞体外实验
• 3 结果
• 3.1 细胞的转染
• 3.2 DLL1 在转染细胞中的表达
• 3.3 DLL1 对下游靶基因的激活
• 3.4 DLL1 对肿瘤细胞体外增殖的作用
• 4 讨论
• 实验三 DLL1 对肿瘤体内生长的作用
• 1 仪器与材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 肿瘤细胞接种
• 2.2 肿瘤生长观察
• 2.3 Evans blue 灌注实验
• 2.4 肿瘤组织RNA的提取
• 2.4 Real-time PCR 检测
• 2.5 组织学分析
• 3 结果
• 3.1 小鼠荷瘤实验
• 3.2 Notch信号通路在肿瘤组织中的激活
• 3.3 Notch对肿瘤血管的影响
• 3.4 肿瘤的缺血和坏死
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢