奶山羊雄性生殖干细胞的分离培养及向精子细胞的诱导分化

论文摘要

雄性生殖干细胞是定居于睾丸曲细精管基底膜的一类干细胞,是雄性个体一生源源不断的精子发生的基础,体外培养可以使其长期稳定增殖、诱导分化为精子细胞及去分化形成多能性细胞。雄性生殖干细胞的研究为诸如雄性不育、干细胞的获取等问题的解决带来了希望。目前,关于分离、培养奶山羊雄性生殖干细胞的系统性的资料还较少,奶山羊雄性生殖干细胞的增殖、分化的机理还很不清楚。本研究比较了奶山羊雄性生殖干细胞分离、培养的条件;检测得到的奶山羊雄性生殖干细胞的生物学特性;体外用维甲酸刺激及转染Stra8基因,验证其向精子细胞分化的可能性;1.奶山羊雄性生殖干细胞分离、培养条件的优化本研究用2 mg/mL胶原酶+ 20μg/mL DNase + 2 mg/mL分解酶（Dispase）（CDD）,结合1 mg/mL胰蛋白酶（Trypsin）+ 10μg/mL DNase（TD）消化奶山羊睾丸组织,能得到足够量且高成活率的精原细胞;用1μg/mL纤维连接蛋白差速2 h纯化奶山羊睾丸细胞悬液得到了纯度较高的奶山羊雄性生殖干细胞（49%）;用DM/F12+20% KSR为基础液,添加2 mmol/L Glu + 0.2 mmol/Lβ–ME + 1% NEAA + 1000 IU/mL LIF + 4 ng/mL bFGF在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养奶山羊雄性生殖干细胞在克隆形成能力、增殖能力及组织非特异性碱性磷酸酶的着色能力都较好;奶山羊的年龄对雄性生殖干细胞的培养效率影响很大,年龄越小,所获得的雄性生殖干细胞越容易培养。用bFGF结合BIO培养的奶山羊雄性生殖干细胞具有更好的增殖能力及克隆形成能力。2.奶山羊雄性生殖干细胞生物学特性的鉴定培养获得了奶山羊雄性生殖干细胞。免疫荧光染色及RT-PCR检测,发现其表达多能性细胞及生殖细胞的标记,而且具有增殖能力,能够向三个胚层的细胞分化。3.奶山羊雄性GSCs向精子细胞的诱导分化体外经维甲酸刺激及转染Stra8基因诱导奶山羊雄性生殖干细胞向精子细胞分化,发现奶山羊雄性生殖干细胞具有RA刺激效应,RA刺激后Stra8基因及减数分裂基因表达上调明显。超表达Stra8基因后,奶山羊雄性生殖干细胞中的减数分裂基因及减数分裂后基因表达上调明显。表明体外诱导奶山羊雄性生殖干细胞向精子细胞分化具有可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 哺乳动物雄性生殖干细胞及其研究进展
• 1.1 雄性生殖干细胞的起源
• 1.2 雄性生殖干细胞的生物学特性和鉴定
• 1.2.1 形态学和组织学特征
• 1.2.2 雄性生殖干细胞的特异性标记
• 1.3 雄性生殖干细胞的体外培养
• 1.3.1 雄性生殖干细胞的分离、纯化
• 1.3.1.1 分离、纯化雄性生殖干细胞时材料的选择
• 1.3.1.2 雄性生殖干细胞悬液的制备
• 1.3.2 雄性生殖干细胞的纯化
• 1.3.2.1 差速贴壁法
• 1.3.2.2 Percoll 密度梯度离心
• 1.3.2.3 流式细胞术（ Flow cytomet ry, FCM）
• 1.3.2.4 免疫磁珠分离技术（MACS）
• 1.3.3 培养液成分的改进与发展
• 1.3.3.1 干细胞生长因子（SCF）
• 1.3.3.2 胶质细胞源神经营养因子（GDNF）
• 1.3.3.3 白血病抑制因子（LIF）
• 1.3.3.4 成纤维细胞生长因子（FGFs）
• 1.3.4 饲养层
• 1.4 雄性生殖干细胞的诱导分化
• 1.5 雄性生殖干细胞的去分化及多能性
• 1.6 雄性生殖干细胞移植的研究进展
• 1.6.1 雄性生殖干细胞移植
• 1.6.1.1 雄性生殖干细胞移植的流程
• 1.6.1.2 受体动物的选择
• 1.6.1.3 供体细胞的获得与体外操作
• 1.6.1.4 移植方法
• 1.7 奶山羊雄性生殖干细胞的研究进展
• 1.8 雄性生殖干细胞研究的前景
• 试验研究
• 第二章 奶山羊雄性生殖干细胞分离、培养条件的优化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 动物组织材料
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 奶山羊睾丸组织的采集
• 2.1.2.2 不同组合的酶消化液的效果比较
• 2.1.2.3 不同细胞外基质对雄性生殖干细胞纯化的效率
• 2.1.2.4 CD49f 的免疫荧光染色
• 2.1.2.5 碱性磷酸酶（AP）染色
• 2.1.2.6 奶山羊年龄对于雄性生殖干细胞培养的影响
• 2.1.2.7 不同基础培养液对奶山羊雄性生殖干细胞培养的影响
• 2.1.2.8 生长因子及小分子化和物对奶山羊雄性生殖干细胞体外增殖、分化的作用
• 2.1.2.9 数据统计方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 三种酶消化法的比较
• 2.2.2 细胞外基质对奶山羊雄性生殖干细胞的纯化效率的影响
• 2.2.3 不同基础液对于奶山羊雄性生殖干细胞培养的影响
• 2.2.4 年龄对奶山羊雄性生殖干细胞培养的影响
• 2.2.5 生长因子及小分子化合物对奶山羊雄性生殖干细胞体外增殖、分化的作用
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 奶山羊雄性生殖干细胞生物学特性的鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 动物组织材料
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 奶山羊雄性生殖干细胞的获取
• 3.1.2.2 奶山羊雄性生殖干细胞株的免疫荧光检测
• 3.1.2.3 奶山羊雄性生殖干细胞株的RT-PCR 检测
• 3.1.2.4 奶山羊雄性生殖干细胞的体外诱导分化
• 3.2 结果
• 3.2.1 奶山羊雄性生殖干细胞的形态学观察
• 3.2.2 奶山羊雄性生殖干细胞的免疫荧光检测
• 3.2.3 奶山羊雄性生殖干细胞的RT-PCR 检测
• 3.2.4 奶山羊雄性生殖干细胞的体外分化潜能
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 奶山羊雄性GSCs 向精子细胞的诱导分化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 主要试剂
• 4.1.1.2 主要仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 睾丸提取液的制作
• 4.1.2.2 奶山羊雄性生殖干细胞的体外诱导
• 4.1.2.3 Stra8 超表达对奶山羊雄性生殖干细胞向精子细胞分化的影响
• 4.1.2.4 定量PCR
• 4.1.2.5 免疫荧光染色
• 4.2 结果
• 4.2.1 RA 及睾丸提取液的作用
• 4.2.2 Stra8 基因对于奶山羊雄性生殖干细胞分化为精子细胞的作用
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 本研究的创新点与进一步研究的课题
• 参考文献
• 缩略语简表
• 致谢
• 作者简介