论文摘要
在玉米育种过程中,理想株高对品种的种植密度和抗倒伏性有重要影响,是育种者追求的重要农艺性状之一。因此,研究玉米株高调控的遗传机制不仅具有重要的理论价值,而且在玉米育种实践中具有巨大的应用潜力。本研究对玉米矮化突变体d2003中的矮化基因进行了精细定位与克隆。该突变体是从玉米自交系K36中发现的一个自然突变体,株高不到K36的1/3,但节数增多,且节间严重缩短。利用旱21xd2003、农531×d2003等F2群体,通过图位克隆的方法克隆了D2003基因。序列分析和等位测验结果表明,它是Viviparous8（Vp8）基因的一个等位基因,编码膜定位的谷氨酸羧肽酶,但它的作用机理目前还没有得到很好的解析。序列比较发现,在d2003的第一个外显子上有一个单碱基“C”的插入,造成移码突变,并产生终止密码子,造成翻译的提前终止。从K36中扩增了D2003基因的全长cDNA序列,构建植物表达载体,并转化D2003在拟南芥中同源基因的突变体ampl,几乎全部转基因植株都恢复到野生型的表型。同时,通过连续回交并结合分子标记辅助选择的方法构建了d2003基因在16个不同遗传背景中的近等基因系,发现d2003在这16个背景中均具有矮化的表型。基因表达分析表明,D2003是一个组成型表达基因,在所检测的几个组织中均有不同水平的表达,但在茎顶端分生组织、幼嫩的叶片和发育中的微管系统中表达量最高,在雄穗中表达量居中,而在雌穗和根中最低。D2003蛋白的亚细胞定位结果显示,其定位情况与内质网标记蛋白HDEI-GFP的定位情况完全重合,表明D2003蛋白在细胞中主要定位在内质网膜上。蛋白结构分析发现,其N端存在着信号肽区域和跨膜区域,当把该区域去掉后亚细胞定位情况发生了明显的变化,不再定位在内质网上。并且,去掉部分N端信号肽编码序列的D2003/Vp8△26AA基因转入拟南芥突变体ampl,不能恢复表型。这些结果表明,D2003蛋白N端的信号肽区域和跨膜区对蛋白质的正确定位以及功能的发挥起着重要的作用。激素处理实验表明,d2003对四种促进细胞分裂或伸长的激素GA3,IAA,6-BA和BR均有不同程度的响应,但是它们都不能使d2003恢复到正常植株的表型。另外,RNA-Seq检测到蛋白激酶基因GRMZM2G035098在d2003和K36之间表达量有很大的差异,该基因在酵母的正常细胞进程中发挥着重要的作用,包括细胞的分裂,细胞的增殖,细胞周期的正常进行和染色质的正常维持等。综合以上结果,在玉米生长发育过程中D2003基因可能通过参与调控细胞的分裂而调节节间的伸长,从而进一步调控玉米的株高。