人脂肪干细胞基本生物学特性、表面抗原及成骨、成脂分化潜能的研究

论文摘要

目的研究人脂肪干细胞的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化潜能。方法①取健康人腹部皮下脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。②cck—8比色法检测1、3、6、10代脂肪干细胞活性,并绘制细胞生长曲线,计算群体倍增时间。③流式细胞仪检测第1、3、6代脂肪干细胞的细胞周期及表面抗原,SPSS11.0软件分析数据。④取第3代人脂肪干细胞,分别用成骨和成脂诱导培养液诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,cck—8比色法检测诱导后的细胞活性,并绘制细胞生长曲线,计算群体倍增时间;RT-PCR检测人脂肪干细胞诱导后成骨细胞特异性骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）及骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）基因的表达和脂肪细胞特异性过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因与CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPa）基因的表达,Western-blot进一步检测OPG蛋白的表达;碱性磷酸酶（ALP）染色、冯库萨（Von Kossa）染色、油红O染色定性鉴定其成骨和成脂分化潜能。结果①形态特征:原代及传代的人脂肪干细胞形态均类似成纤维细胞,生长能力旺盛。②生长曲线及倍增时间:1、3、6、10代人脂肪干细胞的生长曲线大致相同,呈近似“S”形,群体倍增时间约为36h。③细胞周期分析:第1、3、6代人脂肪干细胞中,超过80%的细胞都处于G0/G1期。④表面抗原:第1、3、6代脂肪干细胞表面抗原表达无明显区别,P＞0.05。其中,CD10、CD13、CD55、CD59及CD71表达阳性,CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56及HLA-DR表达阴性。⑤诱导分化:人脂肪干细胞经成骨诱导培养后,细胞增殖速度变慢,群体倍增时间延长至约66h,诱导14d后,RT-PCR检测到OCN、OPN基因的表达,同时,RT-PCR、Western-blot检测到OPG基因与蛋白的表达,ALP染色和Von Kossa染色阳性;人脂肪干细胞经成脂诱导后,细胞增殖速度同样变慢,群体倍增时间延长至约70h,诱导14d后,RT-PCR检测到PPARγ与C/EBPa基因的表达,油红O染色阳性。结论人腹部皮下脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,大多细胞处于静止期,表面抗原CD10、CD13、CD55、CD59、CD71表达呈阳性,CD11b、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56、HLA-DR表达呈阴性,体外培养和传代对其表面抗原的表达无明显影响,能向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化,有望成为组织工程理想的种子细胞来源之一。

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• 结论
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• 参考文献