玉米光周期敏感基因类Hd6的克隆和功能分析

论文摘要

热带、亚热带玉米种质具有丰富的遗传变异,是拓宽我国玉米种质遗传基础和提升育种水平的一个重要途径。然而,玉米光周期敏感是热带、亚热带种质利用的一个主要障碍。因此,分离、克隆控制玉米光周期敏感相关基因并探知其功能,进而揭示光周期敏感的遗传特性和内在分子机制,对热带、亚热带玉米种质的有效利用,以及对植物花发育生物学机理研究的深入,均具有重要的理论和实践意义。本研究以热带玉米自交系CML288为材料,利用同源克隆法结合3’RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。利用荧光定量PCR技术研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达,并且设计了SD（短日照）下的暗期光间断实验,监测类Hd6基因在暗期光间断后的表达变化趋势。构建了类Hd6基因的过量表达载体,通过农杆菌浸染花序法将其转入了拟南芥,观察了转化株的表型并分析了拟南芥光周期相关基因的表达,对类Hd6基因的功能和作用机制进行了探索。主要研究结果如下:1.利用同源克隆结合RACE技术,首次成功克隆了玉米类Hd6基因的编码序列,GeneBank登录号为EF114229。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现,该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源,所推测的氨基酸序列与小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列的同源性分别为95%,96%和92%;序列包含2个CK2活性区域,1个N末端区域,1个ATP结合位点和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶活性位点,具备蛋白激酶CK2α的典型功能区域,能够编码蛋白激酶CK2的α亚基。2.建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统。类Hd6基因表达分析结果发现,该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下,该基因在6-8叶期茎尖中的表达量存在明显差异,在光周期敏感的7叶期出现表达高峰,在叶片中的表达量均低于茎尖;在长日条件下,该基因在茎尖中6叶期表达量较低,在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达;基因的表达高峰期均与前期研究的CML288进行花发育以及光周期敏感的时期相吻合;显示类Hd6基因参与了玉米光周期途径以及雄花分化的过程。对SD下的CML288进行暗期光间断后,类Hd6基因的表达量在茎尖和叶片中均明显下降;光间断处理的天数越多,类Hd6基因的表达量越低;伴随着类Hd6表达量的下降,玉米雄花分花被抑制。类Hd6是一个能够调节玉米光周期敏感性的基因,并可能通过某种途径参与Pfr或Pr光敏色素对光周期中央振荡器的调节,能够维持对暗期效应的感知,促进玉米开花。3.成功构建了玉米类Hd6基因的过量表达载体PBI-HD6,得到拟南芥过量表达植株hd6-ox。类Hd6基因的导入使拟南芥的花期推迟24天左右。在hd6-ox中,导入的类Hd6基因出现震荡式表达节奏,并使中央振荡器基因TOC1基因的表达高峰延迟,GI、CO和FT基因均在光照3h后出现异常的表达高峰,并且CO与FT的表达在夜间出现震荡。表明类Hd6基因与光周期振荡器十分接近,LD下类Hd6基因的导入能造成振荡器紊乱,并以一种未知的途径影响CO和FT基因在夜间的表达,推迟拟南芥的花期。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.光周期敏感现象机制的研究
• 1.1 光周期与光周期敏感
• 1.2 光期和暗期的作用
• 1.3 光周期作用分子机理的研究
• 1.3.1 拟南芥光周期作用分子机理的研究
• 1.3.2 水稻光周期作用分子机理的研究
• 2.玉米光周期敏感现象的研究
• 2.1 热带玉米种质与光周期敏感时期的研究
• 2.2 玉米光周期敏感相关性状基因定位研究
• 2.3 玉米光周期敏感相关基因的克隆和研究
• 3.水稻Hd6基因及其同源基因的克隆和功能研究
• 3.1 水稻Hd6基因的克隆和功能研究
• 3.2 拟南芥CK2基因的克隆和功能研究
• 3.3 其他生物体的CK2基因与光周期
• 3.3.1 CK2与脉孢茵昼夜节律生物钟
• 3.3.2 CK2对果蝇昼夜节律的影响
• 4.同源序列技术与表达序列标签技术（EST）
• 5.实时荧光定量PCR
• 5.1 传统的定量PCR同实时定量PCR技术对比
• 5.2 技术原理
• 5.3 实时荧光定量PCR技术的分类
• 5.4 实时荧光定量PCR技术的应用
• 5.5 应用前景
• 6.拟南芥转基因方法的研究
• 第二章 玉米类Hd6基因的克隆
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 总RNA的提取与纯化
• 1.3.2 cDNA第一链的合成
• 1.3.3 类Hd6基因片段的克隆
• 1.3.4 类Hd6基因的3'端序列克隆
• 1.3.5 类Hd6基因全长的获得与分析
• 2.结果与分析
• 2.1 RNA提取、纯化、第一链合成及检测
• 2.2 目的基因的CDS序列克隆
• 2.2.1 玉米中类Hd6基因的同源序列克隆
• 2.2.2 类Hd6基因全长CDS的克隆
• 2.2.3 类Hd6基因CDS序列与氨基酸序列的分析
• 3.结论与讨论
• 第三章 玉米类Hd6基因的定量表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 光周期处理与取样
• 1.3.1 CML288不同叶龄时期的光周期处理与取样
• 1.3.2 CML288暗期光间断处理与取样
• 1.4 方法
• 1.4.1 总RNA的提取与纯化
• 1.4.2 荧光定量PCR引物的设计
• 1.4.3 标准品制备和标准曲线的建立
• 1.4.4 荧光定量PCR体系和反应条件的优化
• 1.4.5 样品检测与数据计算
• 2.结果与分析
• 2.1 RNA提取、纯化、第一链合成及检测
• 2.2 荧光定量PCR引物的优化和确定
• 2.3 标准品和标准曲线
• 2.4 PCR重复性测验
• 2.5 类Hd6在不同时期和处理下mRNA转录水平比较
• 2.6 类Hd6基因在暗期光间断环境下的表达规律
• 3.结论与讨论
• 3.1 玉米类Hd6基因的表达高峰期与光周期敏感时期相吻合,并呈现震荡式表达规律
• 3.2 玉米类Hd6基因与暗期光间断后表达量降低
• 3.3 玉米类Hd6基因能够促进玉米成花
• 3.4 实时定量PCR技术的应用
• 第四章 类Hd6基因转基因拟南芥
• 1.材料与仪器
• 1.1 植物材料与栽培方法
• 1.2 菌株与质粒载体
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体PBI—Hd6的构建
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 基因序列的扩增
• 2.1.3 表达载体构建
• 2.2 拟南芥转化
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 重组质粒PBI—Hd6的农杆菌电击转化
• 2.2.3 PCR验证及菌种保存
• 2.2.4 拟南芥转化
• 2.3 转基因拟南芥的筛选鉴定
• 2.3.1 转化株卡那霉素浓度敏感性实验
• 0代种子的筛选'>2.3.2 拟南芥T₀代种子的筛选
• 2.3.3 转基因拟南芥PCR与RT-PeT鉴定
• 2.4 拟南芥转化株的表型鉴定和分析
• 1的观察和纯合T₂代植株的获得'>2.4.1 拟南芥转化株T₁的观察和纯合T₂代植株的获得
• 2.4.2 拟南芥类Hd6转化株开花时期的观察
• 2代转化株中光周期相关基因的表达分析'>2.5 T₂代转化株中光周期相关基因的表达分析
• 2.5.1 光周期处理和取样
• 2.5.2 实时定量PCR检测相关基因表达
• 3.结果与分析
• 3.1 植物表达载体PBI—Hd6的构建
• 3.2 重组质粒PBI—Hd6的农杆菌转化结果
• 3.3 转基因拟南芥对卡那霉素的敏感性浓度
• 3.4 转基因拟南芥的筛选
• 3.5 转基因拟南芥的PeR验证
• 3.6 转基因拟南芥的表型观察和比较
• 3.7 hd6-ox转化株的基因表达分析
• 4.结论与讨论
• 4.1 玉米类Hd6基因导致拟南芥在LD下花期延迟
• 4.2 玉米类Hd6基因影响拟南芥光周期途径相关基因的表达
• 4.3 玉米类gd6基因的研究展望
• 参考文献
• 英文摘要