水稻pi-hit-1基因的表达及相互作用蛋白的分析

论文摘要

Pi-hit-1是本实验室采用差异显示PCR（DD-PCR）的方法找到的一个新基因。该基因在空间诱变的稻瘟病敏感品系972-4中的表达水平高于其地面对照品系972ck,并且能够被特定的稻瘟病生理小种诱导表达。生物信息学分析结果表明该基因编码ATP依赖的Clp蛋白酶。为了揭示该基因功能以及在水稻抗逆性中的作用机制,本文采用GST沉降技术从水稻组织总蛋白中寻找其相互作用蛋白。利用本实验室已构建好的融合表达载体pGEX-Pi-HIT-1转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导得到GST-Pi-HIT-1融合蛋白。利用亲和层析的方法纯化得到融合蛋白GST-Pi-HIT-1。用GST沉降技术的方法以纯化好的融合蛋白为诱饵,从水稻组织总蛋白中寻找能够与其相互作用的蛋白。利用液相色谱-电喷雾-串联质谱分析,检测到了七种相互作用蛋白,分别为翻译延伸因子（Elongation factor 1-α）、非特异性脂转移蛋白2前体（Nonspecific lipid-transfer protein 2 precursor）、Zinc knuckle家族蛋白、Fip1结构家族蛋白。另外还有三种功能完全未知的蛋白,分别含有锌指结构、BTB/POZ结构域和TPR样的结构域。这些蛋白分别在DNA复制、转录及翻译调控、细胞凋亡与信号转导、细胞周期调控、植物抗病反应、植物的光合作用及呼吸作用,以及植物体的生长发育过程中发挥了作用。推测编码这些蛋白的基因可能参与Pi-HIT-1相关的稻瘟病抗性改变过程。同时,pi-hit-1基因在上述生物学过程中可能具有相关功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 植物抗病基因研究进展
• 1.2.2 Clp蛋白概述
• 1.2.3 Clp蛋白酶全酶的结构和作用机制
• 1.2.4 Clp蛋白酶生物学功能
• 1.3 蛋白质与蛋白质相互作用研究方法
• 1.3.1 酵母二元杂交体系（Yeast Two-Hybrid System）
• 1.3.2 GST沉降技术（GST Pull Down）
• 1.4 本文研究的目的和意义
• 1.5 本文研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒、菌株
• 2.1.3 酶及主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 常用试剂
• 2.2.2 感受态细胞的制备
• 2.2.3 大肠杆菌细胞转化
• 2.2.4 质粒小规模提取
• 2.2.5 酶切
• 2.2.6 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析
• 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳分析
• 2.2.8 目的蛋白的亲和层析纯化
• 2.2.9 Western blot检测
• 2.2.10 植物组织蛋白质提取
• 2.2.11 蛋白质浓度的测定
• 2.2.12 GST沉降寻找相互作用蛋白
• 2.2.13 液相色谱-电喷雾-串联质谱（LC-ESI-MSIMS）分析
• 2.2.14 水稻的处理方法
• 第3章 实验结果与分析
• 3.1 重组蛋白的原核表达与纯化
• 3.1.1 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.2 重组蛋白的诱导表达
• 3.1.3 重组蛋白的可溶性分析
• 3.1.4 亲和层析纯化融合蛋白
• 3.1.5 纯化蛋白的Western验证
• 3.2 相互作用蛋白的检测
• 3.2.1 水稻总蛋白提取物的Western验证
• 3.2.2 GST沉降技术寻找相互作用蛋白
• 3.2.3 液相色谱-电喷雾-串联质谱结果分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于重组蛋白的表达与纯化
• 3.3.2 关于相互作用蛋白的检测
• 3.3.3 Pi-HIT-1 与植物抗性
• 3.3.4 Pi-HIT-1 可能参与了DNA复制、转录及翻译调控
• 3.3.5 Pi-HIT-1 的其他功能
• 3.4 本章小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 附录1 载体pGEX-4T-2 图谱
• 附录2 液质谱图
• 致谢