中国卤虫API5在早期胚胎发育过程中的表达及其功能研究

论文摘要

中国卤虫隶属于节肢动物门（Phylum Arthropoda）,甲壳动物亚门（Crustacea）,鳃足纲（Branchiopoda）,无甲目（Order Anostraca）,卤虫科（Family Artemiidae）,卤虫属（Genus Artemia）。中国卤虫广泛分布于我国内蒙、西藏、新疆、青海、山西等地的盐湖、盐井等高盐水体中,并且是一种优质的生物饵料被应用于养殖业。Apoptosis inhibitor5（API5）在中国卤虫的胚胎发育过程中起着重要的作用。API5是细胞凋亡抑制相关蛋白,在脊椎动物与无脊椎动物中调控细胞凋亡。本研究采用分子克隆技术,得到长度为403bp的中国卤虫API5基因片段。并利用3’-5’RACE技术,克隆了全长为1711bp的中国卤虫API5基因的cDNA序列。经Blast在线分析软件的分析研究,确定该序列为中国卤虫API5基因（GenBank accession No. : JF808079）。实验利用Real-time PCR技术对API5基因在中国卤虫胚胎发育各时期的表达情况进行分析。结果发现原肠胚时期基因的相对表达量最高;胚胎发育0h～10h, API5基因的相对表达量逐渐升高;胚胎发育15h～40h期间,基因的相对表达量逐渐降低;胚胎发育3d～7d期间,基因的相对表达量逐渐升高;发育10d时,基因的相对表达量下降;总体呈现先升高后降低再升高的趋势。研究表明API5基因是中国卤虫胚胎发育过程中的重要调控基因,并且它在卤虫滞育期具有抑制凋亡以保证胚胎正常发育的功能。实验对其功能进行研究,发现了不同盐度、温度和菌刺激都会对API5基因的表达产生显著影响。使用不同盐度刺激卤虫后,API5基因的相对表达量会随着盐浓度的增加而呈显著升高的趋势（p<0.01）。不同温度刺激卤虫后,API5基因的相对表达量随着温度的降低而呈逐渐升高的趋势。使用革兰氏阴性菌刺激中国卤虫后,API5基因的相对表达量随阴性菌液浓度增加而降低。而使用革兰氏阳性菌刺激中国卤虫后,基因的相对表达量则随阳性菌液浓度的增加而上升。实验表明此基因在各种环境的胁迫下具有抑制凋亡以保证胚胎正常发育的功能。为了进一步了解这些蛋白在进化上的意义,本研究采用MEGA 4.0分析软件,对中国卤虫API5的氨基酸序列与相应蛋白进行分子进化树分析。实验从生物信息学、进化关系和功能鉴定方面对API5基因进行了初步探究,这些结果都将为研究发育生物学以及了解卤虫的滞育奠定了重要的理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 卤虫的研究
• 1.1.1 卤虫的形态学特征、生活习性及地理分布
• 1.1.2 卤虫的生活史
• 1.1.3 卤虫系统分类的研究
• 1.1.4 卤虫的经济价值和生物价值
• 1.2 API5 的研究
• 1.2.1 API5 的发现
• 1.2.2 API5 调控与功能的研究
• 1.3 凋亡抑制蛋白家族的研究
• 1.3.1 细胞凋亡的研究
• 1.3.2 IAP family 的发现、分类及功能研究
• 1.3.3 IAP family 的拮抗剂研究
• 1.3.4 IAP family 功能研究
• 1.4 卤虫胚胎发育相关基因的研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 卤虫的培养
• 2.1.2 实验主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验器材的处理及总RNA 的提取
• 2.2.2 总RNA 模板的纯化
• 2.2.3 反转录反应
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 3’-5’RACE 扩增
• 2.2.6 Real-Time 实时荧光定量PCR
• 2.3 生物信息学分析方法
• 2.3.1 API5 基因序列比对分析方法
• 2.3.2 API5 蛋白质分析方法
• 2.3.3 系统发育进化树分析方法
• 3. 结果
• 3.1 中国卤虫不同发育时期的总RNA
• 3.2 中国卤虫API5 基因PCR 扩增结果
• 3.3 中国卤虫API5 基因3’-5’RACE 扩增结果
• 3.3.1 中国卤虫API5 基因3’RACE 扩增结果
• 3.3.2 中国卤虫API5 基因5’RACE 扩增结果
• 3.3.3 中国卤虫API5 基因的全长序列
• 3.4 中国卤虫API5 基因生物信息学分析结果
• 3.4.1 中国卤虫API5 基因序列分析结果
• 3.4.2 中国卤虫API5 蛋白质序列分析结果
• 3.4.3 系统进化树分析结果
• 3.5 中国卤虫API5 基因在不同胚胎发育时期的表达量
• 3.6 中国卤虫API5 基因的功能研究
• 3.6.1 盐梯度下基因的相对表达量
• 3.6.2 不同温度胁迫下，API5 的相对表达量
• 3.6.3 革兰氏菌浓度梯度下基因的相对表达量
• 4. 讨论
• 4.1 中国卤虫API5 基因的序列分析
• 4.2 中国卤虫 API5 基因在不同胚胎发育时期的表达模式
• 4.3 中国卤虫 API5 基因的功能研究分析
• 4.3.1 中国卤虫 API5 基因在不同盐度下相对表达量的研究分析
• 4.3.2 中国卤虫 API5 基因在不同温度胁迫下相对表达量的研究分析
• 4.3.3 中国卤虫 API5 基因在革兰氏菌梯度下相对表达量研究分析
• 4.4 实验条件与方法的优化处理
• 4.4.1 总RNA 提取方法和总RNA 质量的优化
• 4.4.2 PCR 反应引物设计的优化
• 4.4.3 Real-time PCR 反应条件的优化
• 结论
• 参考文献
• 附录文中所有缩略符号
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢