核苷类似物干预下慢性乙型肝炎患者临床疗效及HBV变异与进化规律的研究

论文摘要

慢性乙型肝炎（CHB）威胁全球人类健康,其中1/3以上的慢性感染者在中国。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的核心治疗措施。核苷类似物（NUC）是目前抗病毒治疗的主流药物。同时,核苷类似物在使用过程中遇到一系列难以回答的问题,例如:核苷类似物耐药的预防和处理;耐药出现后挽救治疗方案如何选择（联合或是序贯）;停药时机的把握等。我们注意到,核苷类似物的耐药问题是上述问题的核心。目前核苷类似物的使用也主要把握两点:一是充分发挥药物的抗病毒功效,另一方面则是尽量避免耐药的发生。然而目前临床使用核苷类抗病毒药物缺乏必要的实验室依据,同时对治疗过程中病毒变异及进化模式和耐药发生机制尚未阐明,这是制约核苷类似物科学合理应用的关键问题。对已经处于慢性HBV感染的大量人群,尤其是已逐渐进入免疫清除期即发病阶段的患者,以持久的抑制HBV复制为首要目标的核苷类似物（NUCs）治疗成为临床治疗的主要手段。通过大量循证医学证据证实,NUCs可以显著减缓和防止乙型肝炎进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌,从而成为目前的主流疗法并广泛使用。大范围NUCs的干预改变了患者体内HBV的多样性、进化速率及演变方向。病毒在药物压力下形成耐药株,耐药株的流行及传播将会对乙型肝炎的流行和防治产生深远影响。核苷类似物对于病毒而言是一种新的环境,在药物作用压力下HBV逆转录酶区（RT区）整体上进化规律如何?RT区是否受到药物正选择压力的作用?我国CHB人群主要为基因B型及C型,核苷类似物疗法对于这两种不同基因型的选择压力是否有所不同?这些问题目前尚缺乏大样本的研究。已有的关于NUCs耐药的研究大多数集中在RT区A至D结构域内,目前常规使用的几种NUCs的耐药位点都已比较明确。HBV基因组50%的基因组为重叠编码区,RT区核苷酸位点的突变同样可以导致表面抗原S区编码氨基酸的改变。由于HBV是以全长序列为遗传单位进行复制和传播,同时也受到宿主免疫及药物压力的选择。宿主免疫压力主要选择位点为S区和C区,而NUCs则主要为RT区。因此,NUCs选择株的变异必然是全基因组范围并且相互关联的。基于此,对NUCs治疗过程中HBV其他编码区（尤其是免疫原性较强的C区和S区）的动态变化的监测对于认识NUCs耐药相关的肝炎突发的机制具有重要意义。同时,由于HBV具有准种特性,宿主免疫和抗病毒药物的作用可能使得该群体中出现对选择压力具有生存优势的变异株,因此阐明HBV准种的变异和进化模式对于CHB的治疗和管理具有指导价值。以往有许多的针对NUCs治疗患者HBV RT区进行的准种方面的研究。然而这些研究均只关注了NUCs作用的靶区域即RT区,而没有对HBV全长进行研究。而新近的对HBV全基因组序列的研究均采用的是PCR直接测序法扩增HBV全长序列,或通过几个扩增片段拼接得到全长序列,而没有采用克隆的方法。因此,NUCs干预下HBV准种全长序列变异及进化模式目前仍未明确。为探讨上述问题,本研究收集了212例LAM耐药而后加用ADV治疗的患者,对不同基因型患者LAM耐药变异模式的差异以及ADV+LAM联合疗法对于不同类型LAM耐药人群的疗效进行了分析。在大样本（1 033例）的接受核苷类似物治疗的患者,采用PCR-直接测序法得到HBV RT区基因序列,进行RT区基因系统进化树构建,利用基于最大似然法的密码子替换模型分别在基因B型及C型序列中检测其可能的正选择作用位点以及差异性位点,以期从整体进化的角度分析RT区基因的进化特征。同时为探索NUCs干预下HBV准种全长序列变异及进化模式,我们纳入了5例核苷类似物序贯/联合治疗的患者以及2例未经治疗但有肝炎发作的患者,采用PCR-克隆测序-种系进化分析方法,对随访过程中的系列血清进行了HBV准种全长序列变异及进化规律的分析。主要结果:一、基因C型患者发生LAM突破的时限长于B型患者（P=0.036）。LAM+ADV联合治疗3个月后,所有患者平均HBV DNA水平较LAM突破时显著下降（P<0.001）。180例（84.9%）患者ALT复常,15例（11.6%）患者出现HBeAg阴转。基因B、C型患者联合治疗后HBV DNA水平、ALT复常率、HBeAg阴转率无明显差异。二、212例患者中共计193例检测出rt204位点变异。L180M与M204V联合变异的频率显著高于M204I（76/80 vs. 28/113,P<0.001）。C型患者检出M204I+L180M变异的频率高于B型患者（P=0.002）,而M204V/I+V207L变异则在B型患者中比例更高（P=0.005）。M204V+L180M、M204V/I+229及M204V/I+S213T变异在基因B、C型患者中的分布无明显差异。42例（19.8%）患者出现多位点（3个及以上位点）耐药变异。三、M204V/I变异联合及未联合rt180、rt229、rt213位点变异组在LAM治疗基线、LAM突破及联合治疗后的HBV DNA水平、ALT水平及复常率上均无明显差异。M204V/I未合并V207L变异组联合治疗后ALT复常率高于M204V/I合并V207L变异组（P=0.001）,而HBV DNA水平无明显差异。四、基因B型RT区序列平均非同义（dN）/同义突变率（dS）比值ω=0.26,正选择位点为rt204位及rt222位氨基酸。基因C型RT区序列平均ω=0.19,正选择位点为rt180位及rt204位氨基酸。五、基因B型及C型RT区序列有六个位点存在选择压力的差异,分别为:rt182 （P=0.08）、rt209（P=0.09）、rt211（P<0.001）、rt226（P=0.04）、rt235（P=0.08）以及rt238（P=0.02）。六、3例LAM初治耐药而后换用其他NUCs治疗的患者HBV全基因组核苷酸及各编码区氨基酸异质性在出现LAM病毒学突破时均降至最低点,而在拯救治疗后又重新增高。接受ADV-替比夫定（LDT）序贯治疗的两例患者基因组异质性的变化则各有其特点。七、2例未治疗组患者在出现肝炎突发时核苷酸及氨基酸异质性均较无症状期升高。八、HBV基因组各编码区在慢性化感染过程中的遗传异质性的变化趋势各不相同,不同的患者也各有其特征。九、5例经NUCs治疗的患者均检测出NUC相关耐药位点变异,3例患者出现多药（重）耐药。所有患者治疗前“a”决定簇均未检测出氨基酸改变,而在治疗后4例患者在该区出现了编码氨基酸的改变。未治疗的两例患者大多数的变异均集中位于前C/C区。十、5例治疗组患者在前S/S区或C区的T细胞或B细胞表位中均出现了伴随RT区变异的编码氨基酸的改变。部分患者在核心启动子区及前C区等也检测到伴随RT区变异的核苷酸突变。通过对这些结果进行分析并和既往研究结果进行比较,结论如下:一、LAM+ADV联合疗法对于不同基因型（B型及C型）及不同LAM变异类型的耐药患者均能够取得较好的疗效。二、基因B型及C型患者LAM补偿耐药位点（L180M及V207L）的分布有一定的差异。LAM初始单药治疗的患者中有一部分可能出现多位点耐药变异,提示对这部分患者初始抗病毒治疗应选择高基因屏障的药物。三、通过大样本HBV RT区基因序列的进化分析,证实在NUCs干预下RT区基因整体上以净化选择的模式为主,少数位点则呈现为正选择的进化模式。基因B型及C型RT区基因在部分非NUC耐药变异位点上所受到的选择压力有所不同。四、不同NUC药物治疗方式对HBV全基因组准种的进化方式有影响:采用LAM初治患者在LAM耐药时病毒异质性降低,而在挽救治疗之后异质性又逐渐升高;而ADV突破后换用其他NUC治疗的患者HBV准种则具有不同的进化规律。五、经NUCs治疗的患者与未治疗但出现肝炎突发的患者HBV准种具有不同的进化及变异模式:未治疗患者在肝炎突发时HBV基因组变化主要集中在前C/C区,而在治疗组患者则未观察到此规律。提示引起NUCs治疗患者与未治疗患者肝炎突发的病毒学机制可能有所不同。六、经NUCs治疗的患者在出现NUCs耐药时均检测出前S/S区和/或C区表位编码氨基酸的改变,提示HBV RT区变异可伴随有其他编码区表位的变化,使得HBV免疫原性发生改变。

论文目录

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• 英文摘要
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• 前言
• 第一部分 拉米夫定联合阿德福韦酯疗法对不同拉米夫定变异类型患者的疗效分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 核苷类似物干预下HBV RT区进化规律的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 核苷类似物干预下HBV准种全长序列变异模式的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 附图
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间撰写的文章