稗草C4关键酶（PEPC、PPDK）基因的克隆及PEPC基因对水稻和烟草的遗传转化

论文题目: 稗草C4关键酶（PEPC、PPDK）基因的克隆及PEPC基因对水稻和烟草的遗传转化

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物生理学

作者: 张桂芳

导师: 赵明,丁在松

关键词: 稗草,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,丙酮酸磷酸双激酶,基因克隆,水稻,烟草,光合效率

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 利用基因工程技术将C4植物光合关键酶基因转入C3植物以提高其光合、水分和氮素的利用效率已成为国内外研究的一个重要方向。稗属（Echinochloa）植物是稻田中典型的C4型杂草,具有适应性广、抗逆性强和生长势强等特点,至今对稗属植物有关C4关键酶的研究与利用仍属空白。本研究以稗草（Echinochloa crusgalli）和家稗（Echinochloa frumentacea）为材料克隆C4关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因,并对水、旱稻和双子叶植物烟草进行了遗传转化,取得了以下结果: 首次从稗草和家稗中成功克隆了完整的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ppc cDNA）（基因登录号为:AY251482,）和丙酮酸磷酸双激酶基因（Pdk cDNA）（基因登录号为:AY792619）,分别被命名为EcPpc和EfPdk。其核苷酸序列总长度分别为2886bp和2838bp,编码蛋白酶的氨基酸残基数分别为961和945。同源与序列对比分析表明这两个基因分别为根型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和C4型丙酮酸磷酸双激酶基因。 将稗草PpC基因分别与强组成性表达的启动子Ubiquitin基因的启动子（pUbi）、在叶组织中受强光调控的特异性表达的特异性启动子1,5二磷酸核酮糖羧化酶基因（Rubisco）小亚基基因启动子（pRbcS）和玉米PEPC基因启动子（pZmp）融合分别构建了3个植物表达载体pUbi-EppC、pRbcS-EppC、pZmp-EppC。 利用己构建的载体以及含有玉米完整的C4型PEPC核基因的表达载体pCB-ZMppc,通过农杆菌介导法对水稻和烟草进行了遗传转化,共获得转化水/旱稻120株和烟草34株。 PCR扩增检测结果证明,多数植株都能扩增出目的基因Ppc和标记基因潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的预知目的片段,而对照植株都没有扩增产物。RT-PCR和Western杂交检测也得到了相应证据。表明稗草Ppc基因已经整合到转基因水稻的基因组中并分别在mRNA和蛋白质水平得到了表达。 对转PEPC基因水稻进行酶活和光合性能的测定表明,转入稗草Ppc基因cDNA的水稻植株,绝大多数PEPC活性明显高于对照,最大为对照的8.07倍;转入玉米PEPC基因的水稻的PEPC活性最大高于对照10倍。初步表明转入完整的基因组DNA表达效果更好。PEPC活性比较结果表明,转入旱稻后PEPC的活性的增加幅度明显高于转入水稻的植株,本研究所获得的PEPC活性最高的植株均为旱稻,初步证明向旱稻内转入Ppc基因,更易得到较高的表达效率。光合性能测定结果表明,转Ppc基因植株光合性能得到了综合改善。净光合速率与气孔导度、蒸腾速率表现正相关（相关系数分别为r2=0.5718、r2=0.4267）。表明外源Ppc基因同时调节了水稻的羧化能力与气孔运动。而且过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率。 将稗草PEPC基因cDNA完整片段和玉米C4特异的Ppc基因转入了双子叶植物烟草,结果表明稗草PEPC基因的cDNA完整片段能够在烟草中正确表达。而转入玉米C4特异的完整Ppc基因的烟草叶绿体破坏严重,分化生长能力较差。可能是由于不正确的转录起始、终止,以及发生错误的拼接,造成玉米C4特异的完整PpC基因不能在烟草中很好的表达。证明种系发生的距离可能会妨碍C4植物基因在C3植物中的正常表达。

论文目录:

摘要

Abstract

缩略语

第一章 绪论

1 立题的背景意义

2 国内外的研究现状

2.1 植物光合途径的可转变性

2.2 C_3、C_4植物对生态环境变化的可适应性

2.3 C_4光合途径的酶促代谢反应

2.4 C_4光合途径的限速反应

2.5 C_4植物和CO_2泵

2.6 C_4关键酶基因研究

2.6.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因

2.6.1.1 基因克隆及其序列比较分析研究

2.6.1.2 PEPC蛋白序列及其结构研究

2.6.1.3 PEPC功能及催化机制的研究

2.6.1.4 PEPC的进化与磷酸化调节研究

2.6.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因工程

2.6.2.1 PEPC对C_3植物的转化及其表达

2.6.2.2 PEPC在C_3植物中表达后的生理影响

2.6.3 丙酮酸磷酸双激酶基因研究

2.6.3.1 PPDK基因的克隆及表达调控研究

2.6.3.2 磷酸双激酶PPDK酶基因工程

2.6.4 用C_4光合酶基因改造C_3植物光合特性可能存在问题

3 本研究的目标和内容

第二章 稗属植物光合关键酶(PEPC、PPDK)基因的克隆

1 材料和方法

1.1 植物材料和试剂

1.2 总RNA的制备

1.3 甲醛变性胶检测RNA

1.4 反转录

1.5 稗草Ppc基因cDNA的克隆

1.6 家稗Pdk基因cDNA的克隆

2 结果与分析

2.1 叶片总RNA及cDNA的电泳检测

2.2 稗草Ppc和家稗Pdk cDNA全长的克隆

2.2.1 稗草Ppc基因的序列测定

2.2.2 家稗Pdk基因的序列测定

2.3 序列比较分析及结构功能预测

2.3.1 稗草Ppc基因及其编码蛋白比较分析

2.3.1.1 稗草Ppc基因同源性检索及序列多重比对分析

2.3.1.2 PEPC编码氨基酸序列同源性检索结果及多重对比分析

2.3.1.3 新克隆稗草Ppc所属基因亚族类型分析

2.3.1.4 PEPC编码蛋白质的功能位点与结构功能域确定

2.3.1.5 PEPC蛋白氨基酸序列的系统进化分析

2.3.2 家稗Pdk基因及其编码蛋白结构序列比较分析

2.3.2.1 Pdk基因测序结果的同源性检索及ORF同源性比较

2.3.2.2 pdkcDNA序列的系统进化分析

2.3.2.3 PPDK编码氨基酸序列同源性检索结果及多重对比分析

2.3.2.4 PPDK蛋白氨基酸序列的系统进化分析

2.3.2.5 家稗PPDK编码蛋白的结构功能域预测

3 讨论

第三章 稗草PEPC基因对水稻和烟草的遗传转化

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的启动子的PCR克隆

1.2.1.1 引物设计与合成

1.2.1.2 PCR扩增

1.2.1.3 扩增产物回收及测序

1.2.2 植物表达载体的改造

1.2.2.1 pUbi-Eppc载体的构建

1.2.2.2 pRbcS-Eppc载体的构建

1.2.2.3 pZmp-Eppc载体的构建

1.2.3 根癌农杆菌的转化

1.2.4 水稻的遗传转化与筛选

1.2.5 烟草的转化与筛选

1.2.5.1 转化

1.2.5.2 筛选

1.2.6 转基因植株的鉴定

1.2.6.1 GUS组织化学检测

1.2.6.2 PCR检测

1.2.6.3 RT-PCR检测

1.2.6.4 Western杂交

1.2.6.5 转基因水稻叶片PEPC活性的测定

1.2.6.6 转基因水稻光合生理测定

2 结果与分析

2.1 玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因启动子的克隆

2.2 植物表达Ppc基因的载体的构建

2.2.1 pUbi-Eppc表达载体的酶切鉴定

2.2.2 pRbcS-Eppc表达载体的酶切鉴定

2.2.3 pZmp-Eppc表达载体的酶切鉴定

2.3 转基因植物的分化及培养

2.3.1 水稻成熟胚愈伤组织诱导及分化苗的培养

2.3.2 烟草叶盘愈伤组织的诱导及分化苗的培养

2.4 转基因植物的检测

2.4.1 GUS组织染色法检测

2.4.2 转基因水稻的分子鉴定结果

2.4.2.1 转基因水稻植株的PCR检测

2.4.2.2 转基因水稻PEPC基因表达的RT-PCR检测

2.4.2.3 转基因水稻PEPC蛋白的Western检测

2.4.2.4 转基因水稻的PEPC活性

2.4.2.5 转基因水稻的气体交换特征

2.4.2.6 转基因水稻可溶性糖和可溶性蛋白含量

3 讨论

第四章 小结

1 基因克隆

2 载体构建

3 水稻和烟草的遗传转化和分子鉴定

4 转基因植物的生理特征

参考文献

致谢

附录

附录一 培养基及常用储存液的配制

附录二 常用分子生物学实验方法

作者简介

发布时间: 2005-07-18

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