东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的筛选和验证

论文摘要

日本血吸虫病（schistosomiasis japonica）作为人兽共患寄生虫病,在我国仍然是一个重要的公共卫生问题。现阶段我国实行的是“以控制传染源”为主、综合治理的血吸虫病防治策略。其中,吡喹酮群体化疗是目前血吸虫病防治措施的基础,但血吸虫病仍在向新的地区蔓延,并且吡喹酮化疗也有一定的局限性,群体化疗并不能防止重复感染,还可能会产生吡喹酮抗性株。因此,在血吸虫病防治策略中,疫苗策略已被认为将是吡喹酮化疗措施的重要补充。目前已有酶性、肌性、膜相关性等多种疫苗候选抗原的基因得到了克隆和表达,并且开展了动物保护性实验,虽然取得了一定的预期效果,但继续寻找新的候选抗原分子以及提高候选疫苗分子的免疫原性仍是血吸虫病疫苗研究的重要方向,通过免疫筛选cDNA文库去发掘更有效的疫苗候选分子是获得新的候选抗原分子的有效途径。发展疫苗的主要目的是降低虫荷和虫卵在肝组织的沉积,因此疫苗的效应应多针对童虫阶段和成虫产卵。东方田鼠（Microtus fortis,Mf）是一种感染日本血吸虫后不致病的哺乳类动物。血吸虫童虫可能是宿主免疫系统较为适合的靶子,若能找到童虫阶段的特异性抗原分子,将血吸虫消灭在此阶段或阻止其生长、发育、成熟、产卵和致病,这不仅可以减轻血吸虫病所造成的病理损害,还可有效地阻止其传播。因此用东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库中,以寻找相关的疫苗候选分子,可能会获得令人满意的结果,并为东方田鼠天然抗日本血吸虫机制的研究提供信息。精氨酸甲基化在血吸虫基因表达调节中起着重要的作用。这是一种翻译后修饰,它参与了多种细胞功能,包括RNA加工处理、细胞信号转导、蛋白亚细胞定位、转录后调节和DNA修复。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）参与基因转录、复制、重组与修复。胞外HMGB1是一种重要的晚期炎症介质,它可以激活巨噬细胞释放TNF-α和IL-13等早期炎症因子。在血吸虫感染中,TNF-α和IL-13对虫卵周围肉芽肿的形成起着重要的免疫诱导作用,可能是宿主感染后免疫调节的关键分子。HMGB1与一些感染性疾病的发病密切相关。本研究从日本血吸虫童虫cDNA文库筛选得到的阳性克隆中选择了蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）编码基因进行研究。首先通过生物信息学分析获得其完整的开放阅读框,然后通过分子克隆技术对这2个基因进行了克隆表达。随后,对纯化重组蛋白reSjcHMGB1开展了动物免疫保护性试验,评价其作为疫苗候选抗原的价值。一、东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的免疫筛选用日本血吸虫天然抗性东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库,将3次复筛获得的阳性克隆转入大肠杆菌（E.coil）BM25.8环化成质粒,抽提质粒DNA,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定,插入片段进行核苷酸序列测序,并进行生物信息学分析。结果,经3次复筛后获得32个阳性克隆,插入片段为300 bp～1 100 bp之间,测序结果经同源性分析,共获得26个不同分子基因:高迁移率族蛋白B1（HMGB1）部分基因,蛋白质精氨酸甲基转移酶部分编码基因,细胞色素b部分编码基因,线粒体编码区基因,16个日本血吸虫未知蛋白编码基因,6个日本血吸虫未知新基因。本研究用东方田鼠血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,获得一批新的日本血吸虫疫苗候选分子的编码基因,为研究血吸虫病疫苗和血吸虫病免疫诊断奠定了基础。二、日本血吸虫蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）1编码基因的克隆、表达和分析依据电子延伸得到的SjPRMT1基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHⅠ酶切位点,下游引物引入XhoⅠ酶切位点。以日本血吸虫成虫总RNA为模板,经反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。纯化PCR产物与pGEM-T载体连接后转化感受态大肠杆菌JM109,抽提重组质粒DNA用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切及核苷酸序列测序进行鉴定。选择阅读框正确的克隆,纯化重组质粒中目的基因双酶切片段,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-SjPRMT1,转化DH5α感受态菌,重组质粒经双酶切和核苷酸序列鉴定后,阳性克隆质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白（简称为reSjPRMT1）,采用SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定该重组蛋白。运用Gene Runner软件预测reSjPRMT1蛋白的二级结构、功能位点及表位特征。结果,RT-PCR扩增出一大小与预期一致的基因片段。TA克隆插入目的片段经核苷酸序列测定,cDNA全长1083 bp,编码360个氨基酸。序列分析表明该片段与SmPRMT1基因序列同源性为87%,推导的氨基酸序列同源性为95%。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析显示,reSjPRMT1重组蛋白的分子质量约43 kDa（包括6个组氨酸）,以可溶性方式表达,可被日本血吸虫感染小鼠血清和抗His-G HRP抗体识别。SjPRMT1基因的克隆、表达获得成功,并获得纯化的重组蛋白,为今后进一步研究其生物学特性以及免疫原性奠定了基础。三、日本血吸虫高迁移率族蛋白B1（HMGB1）编码基因的克隆、表达和免疫保护性研究依据公布的SmHMGB1基因序列设计一对简并引物,上游引物引入BamHⅠ酶切位点,下游引物引入SalⅠ酶切位点。以日本血吸虫成虫总RNA为模板,经反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。纯化PCR产物与pGEM-T载体连接后转化感受态大肠杆菌JM109,抽提重组质粒DNA用BamHⅠ和SalⅠ双酶切及核苷酸序列测序进行鉴定。选择阅读框正确的克隆,纯化重组质粒中目的基因双酶切片段,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-SjHMGB1,转化DH5α感受态菌,重组质粒经双酶切和核苷酸序列鉴定后,阳性克隆质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定该重组蛋白。运用Gene Runner软件预测reSjHMGB1的二级结构、功能位点及表位特征。在免疫保护性实验中,雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,分别为感染对照组、弗氏佐剂对照组、MontanideISA206佐剂对照组、reSjcHMGB1加弗氏佐剂免疫组、reSicHMGB1加MontanideISA 206佐剂免疫组。感染对照组不注射任何抗原和佐剂,两种佐剂对照组小鼠注射乳化的生理盐水加弗氏或Montanide ISA 206佐剂,两免疫组每只小鼠经背部皮下多点注射乳化的20μg reSjcHMGB1加弗氏或Montanide ISA 206佐剂,共免疫3次,间隔2周。末次免疫后2周,小鼠经腹部感染日本血吸虫尾蚴30±1条,攻击感染后6周剖杀小鼠,进行成虫和虫卵计数。并分别于免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,ELISA检测血清中特异性IgG抗体。结果,RT-PCR扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳观察,与预计的一致。TA克隆插入目的片段经核苷酸序列测定,cDNA全长531 bp,编码176个氨基酸。序列分析表明该片段与SmHMGB1基因序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为93%。表达蛋白经SDS-PAGE分析显示,reSjHMG重组蛋白的分子质量约30 kDa（包括6个组氨酸）,以可溶性方式表达。免疫印迹结果显示,日本血吸虫感染小鼠血清、重组抗原免疫小鼠血清和抗His-G HRP抗体均可识别该重组蛋白。生物信息学分析表明该蛋白包含两个保守的结构域（A盒和B盒）及含酸性氨基酸的C末端,同时存在多个潜在的抗原决定簇。在免疫保护性实验中,ELISA结果表明,免疫后重组抗原加两种佐剂免疫组小鼠的特异性IgG抗体水平均显著高于感染对照组和佐剂对照组（P＜0.05）。reSjcHMGB1加弗氏佐剂免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为17.9%和17.6%,其虫荷数和每克肝组织虫卵数（EPG）与感染对照组相比均无统计学意义（P＞0.05）。reSjcHMGB1加Montanide ISA 206佐剂免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为分别为33.2%和11.3%,其虫荷数与感染对照组相比有统计学意义（P＜0.05）,但与ISA 206佐剂对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。本研究成功克隆、表达SjHMGB1,并获得纯化的重组蛋白。在动物保护性实验中,重组抗原并未诱导小鼠产生明显的抗感染和抗生殖免疫保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分: 东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的免疫筛选
• 摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分: 日本血吸虫蛋白质精氨酸甲基转移酶1编码基因的克隆、表达和分析
• 摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分: 日本血吸虫高迁移率族蛋白B1编码基因的克隆、表达及免疫保护性研究
• 摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 致谢
• 附录
• 1. pGEM-T easy-SjcPRMT1测序图
• 2. pET28a-SjcPRMT1测序图
• 3. pGEM-T easy-SjcHMGB1测序图
• 4. pET28a-SjcHMGB1测序图
• 5. 综述