茶多酚对神经干细胞保护作用的研究

论文摘要

神经干细胞（neural stem cell, NSCs）是一类能够自我复制与更新,并增殖分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的干细胞,不仅存在丁：胚胎期,而且也分布于成体神经系统中。成体神经干细胞的发现拓展了神经干细胞的研究范畴,为细胞替代法治疗中枢神经系统疾病提供了良好的种质资源。β淀粉样蛋白（Amyloid-βprotein, Aβ）是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）患者脑内老年斑（Senile plaques, SP）的核心成分,在AD病理进程中发挥着重要的作用,成为体外研究治疗AD的关键性因素。茶多酚（tea polyphenols, TP）是从绿茶的叶中提取出来的一种黄烷醇类物质,因其良好的抗氧化能力和多种药理特性,被广泛地用于脑缺血、抑制肿瘤、防治心血管疾病以及神经退行性疾病等方面的研究。本研究通过观察和检测不同浓度Aβ对神经干细胞的损伤作用,进一步探讨了茶多酚对损伤神经干细胞的保护作用,从细胞水平上研究茶多酚可能的保护机制,为临床上将茶多酚用于防治神经退行性疾病提供实验参考和依据。实验以14-15天的胎鼠脑组织为材料,从海马区分离、体外培养出神经干细胞,免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞特异性表面抗原。以不同浓度的Aβ25-35（10,20,40uM）对神经干细胞进行损伤处理,从形态学观察、细胞存活程度以及过氧化氢酶（CAT）的活性等方面分析神经干细胞的损伤情况,确定出引起细胞损伤的最佳浓度。进一步研究了茶多酚对损伤神经干细胞的影响,从形态学观察、细胞存活率、氧化应激水平（SOD活性和MDA含量变化）、凋亡水平检测方面分析茶多酚对神经细胞的保护作用,并采用RT-PCR去初步探讨了茶多酚发挥保护作用的分子机制。结果如下1.神经干细胞的分离、培养和鉴定：采用机械研磨法从孕14-15天的胎鼠脑组织中分离出单个细胞,接种进行培养,培养3天时出现少量聚集成团的细胞,培养7天时可见较大的神经球,边界清晰,进行传代。对传代3次后的神经球和血清诱导后的神经干细胞采用免疫细胞化学法鉴定Nestin、GFAP、NSE呈阳性表达,说明分离培养出具有增殖和多向分化潜能的神经干细胞。2.Aβ25-35引起的神经干细胞损伤作用：不同浓度凝聚态Aβ25-35 （5、10、20umol/L）与传代3次后的神经干细胞共培养,镜下观察细胞的形态变化发现细胞体积变小、胞核不完整、折光性下降以及出现凋亡小体等特征；吉姆萨染色进一步说明存在有凋亡的细胞。收集培养6、12、24、36、48h后的细胞,台昐蓝染色计数细胞存活率,结果显示：与对照组相比,共培养24h时,10umol/LAβ25-35组细胞存活率显著下降（P<0.05），20umol/LAβ25-35组细胞存活率极显并下降（P<0.01）。检测共培养24h时各组细胞中CAT活力,结果表明：与对照组相比,Aβ25-35实验组中CAT活力均下降并呈现一定的浓度依赖性,5umol/L和lOumol/L Aβ25-35细胞CAT活力有所下降,但不具有统计学意义（P>0.05）:20umol/LAβ25-35组细胞CAT活性极显著下降（P<0.01）。3.茶多酚对损伤神经干细胞的影响：与Aβ25-36组相比,不同浓度TP （10、20、40ug/ml）均能提高细胞的存活率,保护细胞形态的完整性,其中20ug/mlTP对损伤细胞的保护作用差异极显著（P<0.01）。可见光法测定细胞SOD活力和MDA含量,结果显示：Aβ25-35组中SOD活性明显下降（P<0.05）,MDA含量显著增加（P<0.01）；与Aβ25-35组相比,10ug/mlTP组SOD活性升高且MDA含量下降,但差异不显著（P>0.05）; 20ug/mlTP组中细胞SOD活性极显著地提高（P<0.01）,MDA含量下降但不具有统计学意义；40ug/mlTP处理组中SOD活力下降,差异显著（P<0.05）,同时MDA含量升高,差异显著（P<0.05）. DNA ladder检测细胞凋亡显示20umol/L Aβ25-35组出现明显的细胞凋亡梯带,不同浓度TP组中凋亡梯带的数量不同。RT-PCR检测凋亡相关基因表达显示：对照组中无bcl-2和bax; Aβ25-35组中bax较强表达,仅有很弱的bcl-2表达；TP处理组中bcl-2、bax均表达,其中20ug/mlTP中表达的bcl-2最强。综上所述,本研究表明凝聚态的Aβ25-35对神经干细胞具有损伤作用,可破坏细胞的形态、结构,降低细胞存活率及CAT的活性;茶多酚对Aβ25-35引起的神经干细胞损伤具有一定的保护作用,能够拮抗细胞的氧化应激和凋亡作用,为将茶多酚更好地用于治疗阿尔茨海默病等神经系统疾病提供理论参考和依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 阿尔茨海默病与β淀粉样蛋白
• 1.1.1 β淀粉样蛋白的形成和代谢
• 1.1.2 β淀粉样蛋白致AD的作用机制
• 1.2 神经干细胞研究概述
• 1.2.1 神经干细胞的来源
• 1.2.2 神经干细胞的增殖和分化
• 1.3 神经干细胞在阿尔茨海默病治疗中的应用
• 1.3.1 激活内源性神经干细胞
• 1.3.2 异体神经干细胞的移植
• 1.3.3 基因治疗
• 1.4 茶多酚及其在神经保护中的作用
• 1.4.1 茶多酚的神经保护作用
• 1.4.2 茶多酚发挥神经保护作用的主要机制
• 1.5 本课题的研究目的与意义
• 25-35对神经干细胞的损伤作用'>第2章 Aβ_25-35对神经干细胞的损伤作用
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂及其配制
• 2.1.3 主要设备和器械
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胎鼠神经干细胞的分离与培养
• 2.2.2 神经干细胞的诱导分化
• 2.2.3 神经干细胞的鉴定
• 25-35对神经干细胞的损伤作用'>2.2.4 Aβ_25-35对神经干细胞的损伤作用
• 2.2.5 实验数据分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 体外培养的神经干细胞形态观察
• 2.3.2 观察诱导分化的神经干细胞
• 2.3.3 神经干细胞的鉴定
• 25-35对神经干细胞形态的影响'>2.3.4 Aβ_25-35对神经干细胞形态的影响
• 25-35对神经干细胞存活的影响'>2.3.5 Aβ_25-35对神经干细胞存活的影响
• 2.3.6 A民5一3:对神经干细胞过氧化氢酶（CAT）的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 神经干细胞的分离培养
• 2.4.2 体外培养的神经干细胞的鉴定
• 25-35对神经干细胞的损伤及其检测'>2.4.3 Aβ_25-35对神经干细胞的损伤及其检测
• 第3章 茶多酚对损伤神经干细胞的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验分组
• 3.2.2 Gimesa染色观察细胞的形态变化
• 3.2.3 计数细胞存活率
• 3.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 3.2.5 丙二醛（MDA）含量的测定
• 3.2.6 DNA ladder检测神经干细胞的凋亡
• 3.2.7 RT-PCR检测凋亡相关基因的表达
• 3.2.8 实验数据分析
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 不同浓度TP对神经干细胞形态的影响
• 3.3.2 不同浓度TP对神经干细胞存活率的影响
• 3.3.3 不同浓度TP对细胞SOD活性的影响
• 3.3.4 不同浓度TP对细胞MDA含量的影响
• 3.3.5 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
• 3.3.6 RT-PCR检测神经干细胞凋亡相关基因的表达结果
• 3.4 讨论
• 25-35诱导的细胞氧化应激反应的影响'>3.4.1 茶多酚对Aβ_25-35诱导的细胞氧化应激反应的影响
• 25-35诱导的细胞凋亡的影响'>3.4.2 茶多酚对Aβ_25-35诱导的细胞凋亡的影响
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果