稻瘟病菌中与碳分解代谢阻遏相关的转录因子MoCreA功能分析

论文摘要

稻瘟病菌iMagnaporthe oryzae)引起的稻瘟病严重制约着世界粮食安全,因此,对稻瘟病害的防治已刻不容缓。了解稻瘟病菌响应外部环境的相关信号途径对于研究稻瘟病的防控有很重要的作用。碳代谢分解阻遏（carbon catabolite repression, CCR）是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源（通常为葡萄糖）,而速效碳源的分解产物又阻遏利用其他碳源组分所需要的酶类的合成的一种调节机制。该机制广泛存在于微生物有机体中,而目前对于CCR相关基因在稻瘟病菌中的生物学功能却知之甚少。稻瘟病菌中的MoCreA是一个含有锌指结构的转录因子,与酵母中调控CCR途径的Migl同源。MoCreA在稻瘟病菌各生长阶段及致病过程中均有转录；在葡萄糖诱导环境中定位在细胞核中；MocreA的敲除突变体菌丝体生长分别受葡萄糖、木糖、乙醇以及蔗糖抑制；在以2-脱氧葡萄糖和CMC为共同碳源的培养基上生长时,MocreA缺失突变体可以正常生长,而野生型菌株的生长速度明显减慢70%左右；在淀粉和葡萄糖同时存在时,MocreA敲除突变体能同时利用这两种碳源,而野生型只能先利用完葡萄糖,再利用淀粉；在葡萄糖诱导环境中,MocreA的敲除突变体的部分细胞壁降解酶表达量显著上升；MocreA缺失突变体的产孢量显著下降约90%,主要原因在于分生孢子梗减少,同时,分生孢子的萌发和附着胞形成均延迟,且附着胞形成率下降,但孢子的形态不受影响；MocreA缺失突变体活体接种在水稻CO-39上,与野生型相比致病性显著下降,DAB染色可见在叶鞘的侵染位点处有大量ROS积累；而来自稻瘟病菌野生型菌株中的MoCreA基因转入MoCreA突变体后,可以恢复突变体的以上所有缺陷表型。因此,稻瘟病菌中MoCreA可能通过参与调控CCR途径以及活性氧物质清除过程,影响其他相关酶基因的表达,从而在稻瘟病菌的定殖、扩展过程中发挥着重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一 前言
• 1、稻瘟病菌及其侵染循环
• 1.1 稻瘟病及稻瘟病菌
• 1.2 稻瘟病菌的侵染循环
• 2 稻瘟病菌细胞壁水解酶的研究进展
• 3 真菌的碳分解代谢阻遏作用及其研究进展
• 3.1 碳代谢阻遏在酿酒酵母中的研究进展
• 3.2 碳代谢阻遏在构巢曲霉中的研究进展
• 3.3 碳代谢阻遏在粗糙脉胞菌中的研究进展
• 3.4 碳代谢阻遏在球孢白僵菌中的研究进展
• 3.5 碳代谢阻遏在核盘菌中的研究进展
• 3.6 碳代谢阻遏在其他真菌中的研究进展
• 4 稻瘟病菌与活性氧物质之间的关系
• 5 本研究的意义
• 二. 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验植物
• 1.2 实验菌株
• 1.3 实验所用载体
• 1.4 实验所用生化试剂
• 1.5 实验所用培养基
• 2 实验方法
• 2.1 稻瘟病菌中碳代谢阻遏因子氨基酸序列获得以及生物信息学分析
• 2.1.1 稻瘟病菌中碳代谢阻遏因子氨基酸序列获得
• 2.1.2 稻瘟病菌中碳代谢阻遏因子理化性质分析
• 2.1.3 稻瘟病菌中碳代谢阻遏因子系统进化树分析
• 2.1.4 稻瘟病菌中碳代谢阻遏因子氨基酸序列保守性分析
• 2.2 稻瘟病菌菌丝体、孢子、附着胞以及不同时间段侵染水稻叶片总RNA提取
• 2.3 RNA反转录
• 2.4 荧光实时定量PCR
• 2.5 SOE方法基因敲除
• 2.5.1 SOE基因敲除的方法
• 2.5.2 PCR扩增目的基因反应体系以及程序
• 2.6 稻瘟病菌原生质体制备以及转化
• 2.6.1 稻瘟病菌原生质体制备
• 2.6.2 稻瘟病菌原生质体转化
• 2.7 稻瘟病菌基因组DNA粗提
• 2.8 稻瘟病菌功能互补突变体及GFP融合载体的构建
• 2.8.1 酶切体系（本实验所用酶为Spe1和Not1）
• 2.8.2 连接体系
• 2.9 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.9.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.9.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.10 质粒提取
• 2.11 稻瘟病菌基因GFP融合蛋白荧光诱导
• 2.12 稻瘟病菌过量表达载体的构建
• 2.13 稻瘟病菌生长发育以及致病性功能分析
• 2.13.1 稻瘟病菌菌落直径测定
• 2.13.2 稻瘟病菌菌丝生长培养基碘液染色实验
• 2.13.3 稻瘟病菌产孢量统计
• 2.13.4 稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率统计
• 2.13.5 稻瘟病菌分生孢子梗观察
• 2.13.6 稻瘟病菌致病性分析
• 2.13.7 稻瘟病菌叶鞘接种以及DAB染色实验
• 三 结果与分析
• 3.1 稻瘟病菌中碳代谢阻遏基因生物信息学浅析
• 3.1.1 稻瘟病菌碳代谢阻遏相关基因的氨基酸序列及结构域分析
• 3.1.2 稻瘟病菌MoCreA的系统进化分析
• 3.2 MoCreA的功能分析
• 3.2.1 MoCreA在稻瘟病菌各生长发育阶段及致病过程中均有转录
• 3.2.2 MoCreA在稻瘟病菌中的表达受自我抑制调控
• 3.2.3 MoCreA在葡萄糖诱导下定位在稻瘟病菌细胞核中
• 3.3 稻瘟病菌MoCreA功能分析
• 3.3.1 MoCreA敲除及功能互补突变体的筛选与鉴定
• 3.3.2 MoCreA过表达突变体的筛选与鉴定
• 3.3.3 MoCreA影响稻瘟病菌对不同碳源的利用
• 3.3.4 MoCreA调控稻瘟病菌在含2-脱氧葡萄糖的混合碳源的培养基的生长
• 3.3.5 在存在葡萄糖时,MoCreA抑制稻瘟病菌对其他碳源的利用
• 3.3.6 MoCreA敲除突变体和功能互补突变体中细胞壁降解酶的表达量变化
• 3.3.6.1 完全培养基中MoCreA敲除突变体中的细胞壁降解酶的表达量下降
• 3.3.6.2 加入葡萄糖和淀粉的基本培养基中,MoCreA敲除突变体中的细胞壁降解酶的表达量
• 3.3.7 MoCreA的敲除导致稻瘟病菌产孢量下降
• 3.3.8 MoCreA的敲除导致稻瘟病菌致病性的基本散失
• 四 小结与讨论
• 4.1 稻瘟病菌中碳代谢阻遏子MoCreA存在结构域保守性
• 4.2 稻瘟病菌中MoCreA的转录可能存在自我抑制机制
• 4.3 MoCreA在葡萄糖诱导下定位在稻瘟病菌细胞核中
• 4.4 MoCreA影响稻瘟病菌对碳源的利用
• 4.5 MoCreA影响了稻瘟病菌部分细胞壁降解酶的转录
• 4.6 MoCreA缺失严重影响了稻瘟病菌产孢量以及致病性
• 五 展望
• 参考文献
• 附录 本研究中所使用的引物
• 致谢