成人骨髓源性神经干细胞致瘤性的分子遗传学研究

论文摘要

最近研究表明,成人骨髓基质细胞在体外可诱导分化成为神经干细胞,并且成人骨髓源性神经干细胞具有和自身脑源性神经干细胞相似的生物学特征。成人骨髓源性神经干细胞的应用可以避免诸如取材困难、免疫排斥及伦理学问题等困扰着脑源性、及胚胎源性神经干细胞应用所遇到的各种难题。骨髓源性神经干细胞自身具有的特征及优势使其在应用成体干细胞治疗人类神经系统疾病及损伤方面具有良好的临床应用前景。然而,在临床应用前对于成人骨髓源性神经干细胞在移植后的长期安全性问题是一有待深入探索的研究课题之一。致瘤性是成体干细胞临床应用安全性方面一个重要的关注问题。有研究表明,体外培养的小鼠源性的骨髓基质细胞可表现出快速增殖、失去接触抑制及异常的细胞核表型改变等生物学特征,并且在将这些细胞移植于裸鼠或同系基因型的免疫缺陷小鼠体内后可导致肿瘤生成。再者,干细胞与肿瘤细胞有着很多相似的特征,有一理论假说认为肿瘤细胞中包含了少量被称为肿瘤干细胞的细胞,它们有着无限的自身增殖能力,并且可以导致肿瘤形成。因而,对临床应用的干细胞的致瘤性研究显得非常重要。目前为止,并没有明确的证据证明成人骨髓源性神经干细胞不存在致瘤性的可能。而对于成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性问题,在前期工作中我们进行了染色体分析、体外凝集试验以及裸鼠成瘤试验等一系列研究,发现成人骨髓源性神经干细胞染色体形态、数目及结构正常,体外无凝集反应,接种裸鼠6个月无肿瘤形成,为评价其致瘤性提供了初步的实验依据。我们认为,对于成人骨髓源性神经干细胞的致瘤可能性不能仅依据体外实验或动物实验而完全排除,因为成人骨髓源性神经干细胞在人体内的生长条件和在培养皿中或动物体内存在很大的区别。在移植之后,成人骨髓源性神经干细胞在人体内可能存在一段难以估计的较长时期,在这段时期其可能发生很多变化,因而对于成人骨髓源性神经干细胞在人体内是否会发生恶性转变目前仍然还不能确定。对移植前的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性进行研究,能为评估其在移植后于人体内长期存在的过程中发生恶性转变的风险提供有意义的参考依据。因为致瘤性可归因于遗传异常,在本研究中我们对成人骨髓源性神经干细胞中数百个肿瘤相关基因进行分析,目的是为了明确该细胞中是否存在某些基因特征可以有助于对其致瘤性的评价。第一章成人骨髓源性神经干细胞的获得与鉴定目的建立一种快速有效的由成人骨髓基质细胞在体外诱导培养获得成人骨髓源性神经干细胞方法,并从细胞形态、标志性蛋白的表达及体外诱导分化成为神经系细胞的能力等方面对成人骨髓源性神经干细胞进行检测。材料与方法抽取正常成人志愿者全骨髓,应用密度梯度离心法分离成人骨髓基质细胞,体外培养纯化及扩增成人骨髓基质细胞,以神经干细胞培养基体外诱导培养成人骨髓基质细胞成为成人骨髓源性神经干细胞,以诱导培养基于体外诱导培养成人骨髓源性神经干细胞向神经系细胞分化。相差显微镜下观察成人骨髓基质细胞及成人骨髓源性神经干细胞的形态学特征;免疫组化法检测成人骨髓源性神经干细胞中神经干细胞标志性蛋白Nestin的表达,以及由成人骨髓源性神经干细胞诱导分化后得到的神经系细胞中神经胶质细胞标志性蛋白GFAP、少突胶质细胞标志性蛋白NG2及神经元标志性蛋白MAP2ab的表达。结果传代纯化后的成人骨髓基质细胞贴壁生长,呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛,几乎不表达Nestin。经10～15天诱导培养,成人骨髓基质细胞分化为成人骨髓源性神经干细胞,成人骨髓源性神经干细胞由细胞克隆聚集成神经球样结构,不贴壁生长,增殖旺盛,高度表达Nestin。经7～10天诱导培养,成人骨髓源性神经干细胞体外分化成神经系细胞,细胞可表达GFAP、NG2及MAP2ab。结论1.成人骨髓基质细胞可在体外快速诱导分化成为成人骨髓源性神经干细胞。2.成人骨髓源性神经干细胞具有神经分化的能力,在体外可进一步诱导分化成为神经系统的细胞类型。3.成人骨髓基质细胞可为成人骨髓源性神经干细胞提供丰富的细胞来源。第二章成人骨髓源性神经干细胞中重要抑癌基因的突变检测目的对成人骨髓源性神经干细胞中重要抑癌基因p53、Rb1和p16基因的常见突变点进行序列分析,观察是否存在异常的突变现象,从抑癌基因水平研究成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性问题。材料与方法提取成人骨髓源性神经干细胞的基因组DNA,应用PCR-DNA测序技术,设计特定PCR引物,PCR扩增成人骨髓源性神经干细胞p53基因第5～9外显子、Rb1基因第19-21外显子以及p16基因第1～2外显子,并对扩增片段进行DNA测序。结果成人骨髓源性神经干细胞中p53基因第5～9外显子、Rb1基因第19～21外显子以及p16基因第1～2外显子的序列均与野生型一致,未见突变现象。结论由成人骨髓基质细胞体外诱导培养形成的成人骨髓源性神经干细胞未发现重要抑癌基因的常见突变现象,此结果为评价成人骨髓源性神经干细胞体内移植的致瘤性提供了有意义的参考依据。第三章成人骨髓源性神经干细胞中肿瘤相关基因的表达检测目的检测成人骨髓源性神经干细胞中肿瘤相关基因的表达情况,为评价其移植后的致瘤性提供依据。材料与方法实验分组:实验组:成人骨髓源性神经干细胞;对照组:新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞。提取总RNA;以肿瘤基因芯片Oligo GEArray Human CancerMicroarray OHS-802检测成人骨髓源性神经干细胞中440个肿瘤相关基因的表达水平;以实时定量RT-PCR的方法对成人骨髓源性神经干细胞中基因芯片检测结果显示呈高度表达的部分重要癌基因进行检测。结果基因芯片检测结果显示,与新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞相比较,成人骨髓源性神经干细胞中有66个肿瘤相关基因呈高度表达（＞3倍）,呈高度表达的基因中包含了促进细胞增殖、促进细胞侵袭和转移及一些重要致癌性信号传导通路的成员等基因。实时定量RT-PCR检测结果显示,与新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞相比较,所检测的癌基因MYC、MMP2、Notch2、STC1、ITGA3、STAT5b、RhoC及Wnt1在成人骨髓源性神经干细胞中均呈高度表达,与基因芯片检测的结果相符,其表达倍数分别是:MYC（4.35×100）、MMP2（2.84×100）、Notch2（2.87×100）、STC1（3.41×102）、ITGA3（2.22×102）、STAT5b（6.99×100）、RhoC（4.92×100）、Wnt1（3.64×100）。结论1.成人骨髓源性神经干细胞中存在大量的肿瘤相关基因的高度表达,其可能的生物学意义有待进一步深入研究。2.高度表达的基因中包括了一些重要的癌基因,其激活与人类肿瘤的发生发展密切相关。3.本研究的结果为评价成人骨髓源性神经干细胞体内移植的致瘤性提供了有意义的参考依据。4.本研究的发现强调了对成人骨髓源性神经干细胞的长期致瘤性进行深入研究的重要性及必要性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 成人骨髓源性神经干细胞的获得与鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 1.6 附图
• 第二章 成人骨髓源性神经干细胞中重要抑癌基因的突变检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 2.5 参考文献
• 2.6 附图
• 第三章 成人骨髓源性神经干细胞中肿瘤相关基因的表达检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 3.5 参考文献
• 3.6 附图
• 全文总结
• 综述一
• 综述二
• 中英文对照与缩略词表
• 学习期间发表论文
• 致谢