核糖体展示ScFv文库的构建及使用核糖体展示技术筛选壬基酚抗体

论文摘要

壬基酚（Nonylphenol,NP）是已经确认的环境内分泌干扰物之一,且在环境中的污染状况不容乐观,对其进行监测和评估是环境监测和治理的一项重要内容。使用仪器进行检测虽然准确,但费时、费力、成本高。而快速生物检测技术如免疫学检测的基础是需要有该小分子污染物的特异抗体。基因工程重组单克隆抗体（recombination monoclonal antibody,RMA）是90年代以来,人们利用基因工程重组技术,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰,或者直接合成基因序列,再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体,其化学结构特点与单克隆抗体相同,具有稳定的免疫特异性。其中单链抗体（singe chain variable fragment,ScFv）由于低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强,成本低,可大规模生产等特点已应用于医学领域。单链抗体可以通过噬菌体展示技术或核糖体展示技术加以制备。其中,核糖体展示技术完全在体外进行,库容量远远大于噬菌体展示文库,此外核糖体展示技术具有简便的建库和筛选方法,勿需选择压力,通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力。上述优点都使核糖体展示技术显示出了诱人的发展前景。本实验利用核糖体展示抗体库库容量大（可达1013-1015）的优势与天然抗体库的通用性,以环境内分泌干扰物壬基酚的抗原（NP-BSA）为靶标,从未经免疫的不同品系（Balb/C、C57）小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一链后,设计多对适当引物扩增VH、VL基因片段,构建的单链抗体文库重链H和轻链L大小都为350bp左右,设计引物从载体PT7PD扩增出间隔序列P（大小为294bp）,核糖体展示元件T（大小为93bp）采用全基因合成方法得到。以重叠引物延伸法将这几段序列拼接,先将核糖体展示元件T与重链H连接,间隔序列P与轻链L连接,分别纯化回收后再经linker（Gly3Ser）4连接,将TH和LP连接成全长ScFv片段,大小约为1100bp,从而构建了核糖体展示鼠源天然抗体基因库,体外鉴定该天然抗体基因库的转录活性、反转录活性和蛋白质水平的活性。将构建的单链抗体基因文库进行体外转录和体外翻译后,产生了单链抗体-核糖体-mRNA（ARM）三联复合体文库。以小分子抗原壬基酚为靶标,利用固相亲和方法筛选该三联复合体,洗涤后,通过改变Mg2+浓度将筛选得到的ARM复合物解离,得到相应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。通过多轮生物淘筛,抗原阳性的单链抗体得到富集,最终获得高特异性抗壬基酚的抗体。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达并进行初步鉴定,因为所用天然抗体库本身具有的通用性,理论上可以以任意抗原为靶标筛选其亲和抗体,这就为利用核糖体展示技术从天然抗体库中筛选多种抗原特别是小分子半抗原的特异性抗体奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 1. 核糖体展示技术概况
• 2. 核糖体展示技术的应用
• 2.1 筛选目标蛋白
• 2.2 实现蛋白质的体外进化
• 3. 核糖体展示技术的前景与展望
• 4. 壬基酚污染状况、危害及快速检测的现状
• 正文
• 1. 概述
• 2. 实验材料与设备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 工具酶和试剂盒
• 2.1.3 其他化学或生物试剂
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 引物合成与测序
• 2.1.6 其他部分试剂配方
• 2.2 主要仪器设备
• 3. 实验方法
• 3.1 技术路线图
• 3.2 壬基酚蛋白结合物的鉴定
• TM 蛋白定量试剂盒测定壬基酚蛋白结合物中蛋白含量'>3.2.1 BCA^TM蛋白定量试剂盒测定壬基酚蛋白结合物中蛋白含量
• 3.2.2 紫外光谱分析
• 3.2.3 SDS-PAGE 分析
• 3.3 小鼠 ScFv 库的构建过程
• 3.3.1 总 RNA 的提取
• 3.3.2 核糖体展示抗体基因库的构建
• 3.4 DNA 文库的鉴定
• 3.4.1 DNA 文库的多样性鉴定
• 3.4.2 DNA 库的活性鉴定
• 3.5 建库后的体外筛选和RT-PCR 过程
• 3.5.1 筛选部分
• 3.5.2 RT-PCR 重新构建核糖体展示模板
• 3.6 筛选后鉴定
• 3.6.1 筛选结果测序
• 3.6.2 抗体片段的可溶性表达与鉴定
• 4. 结果与分析
• 4.1 壬基酚蛋白结合物的鉴定
• 4.1.1 结合物溶液中蛋白浓度的测定
• 4.1.2 紫外可见分光光度计扫描法鉴定及结合比的计算
• 4.1.3 蛋白质电泳法鉴定
• 4.2 小鼠脾脏总RNA 的提取
• 4.3 重链、轻链、间隔序列以及核糖体展示元件的扩增
• 4.4 重链（VH）、轻链（VL）、间隔序列（P）以及核糖体展示元件（T）的连接
• 4.5 DNA 文库的鉴定
• 4.5.1 测序结果
• 4.5.2 单链抗体库库容量的计算方法
• 4.5.3 文库活性鉴定
• 4.6 体外转录与翻译
• 4.7 体外筛选
• 4.8 筛选后的鉴定
• 4.9 表达产物鉴定
• 4.9.1 SDS-PAGE 鉴定表达蛋白分子量
• 4.9.2 ELISA 法测定单链抗体与抗原结合特异性
• 5. 讨论
• 5.1 单链抗体
• 5.2 抗体库技术
• 5.3 核糖体展示模板的构建
• 5.4 体外翻译
• 5.5 体外筛选
• 5.6 体外表达和 ELISA 鉴定
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢