斑马鱼（Danio rerio）母源性补体因子的传递和免疫功能以及补体系统的个体发育

论文摘要

多数鱼类卵子体外受精,胚胎在体外充满大量各种微生物的环境中发育。此外,鱼类胚胎在孵化时,淋巴系统仍在发育之中,它合成免疫相关成分的能力有限。鱼类胚胎是如何抵抗各种微生物感染而存活下来的?这是鱼类生殖和发育免疫学的中心议题之一。已有证据表明:鱼类卵子中存在母源性免疫因子,如IgM、溶菌酶、凝集素和补体C3等。然而,关于这些母源性免疫成分特别是补体成分的功能尚不清楚。本论文主要针对母源性补体因子的传递及其功能进行研究。另外,还研究了补体系统的个体发育和成熟。本论文第一部分主要研究了斑马鱼母源性补体的免疫功能及其作用机制。我们首次通过体外实验证明了革兰氏阴性菌大肠杆菌能够被斑马鱼受精卵的胞浆（即卵子提取物,也叫无细胞体系）所杀灭。这些结果都表明,斑马鱼母源性补体系统在卵子的溶菌活性中起重要作用。首先,在斑马鱼卵无细胞体系中加入一定浓度的C3抗体使补体C3沉淀失活能够显著降低其抑菌活性,而C3正是所有补体激活途径中的关键因子。另外,将斑马鱼卵无细胞体系在45℃水浴30 min后,其抑菌活性也显著降低,而该温度足以使鱼类的补体灭活。通过补体途径的抑制实验证明,斑马鱼早期胚胎主要是通过替代性补体激活途径来发挥溶菌作用。首先,在斑马鱼卵无细胞体系中分别加入适量C1q（经典途径关键成分）抗体和C4（同时参与经典途径和凝集素途径）抗体分别沉淀C1q和C4后,卵子胞浆的溶菌活性并未发生明显变化,而加入Bf（仅在替代途径中起重要作用）抗体使Bf沉淀却能够显著降低卵子胞浆的溶菌活性。其次,在斑马鱼卵无细胞体系中加入EGTA螯合Ca2+而抑制经典途径和凝集素途径对卵子胞浆的抑菌活性并无显著影响,而加入EDTA同时螯合Ca2+和Mg2+使替代途径受到抑制后,溶菌活性则显著降低。再次,在EDTA处理过的斑马鱼卵无细胞体系中补充足量Mg2+可以在一定程度上恢复卵子胞浆的溶菌活性,而补充Ca2+却不能使溶菌活性得到恢复。最后,在斑马鱼卵无细胞体系中加入经典途径特异性抑制剂L-赖氨酸对卵子胞浆的抑菌活性几乎没有影响,而加入替代途径的特异性抑制剂酵母聚糖则能够在很大程度上降低卵子胞浆的溶菌活性。本论文第二部分主要研究了母源性补体成分的传递及其对后代的免疫保护作用。实验表明,斑马鱼母源补体因子可以传递给胚胎并在胚胎的抗感染作用中起重要作用。首先,以灭活的嗜水气单胞菌免疫雌鱼不仅能提高亲鱼体内补体关键成分C3和Bf的含量,而且其所产生的卵子中相应蛋白含量也显著升高,说明母源性补体可以传递给后代。其次,雌鱼免疫后不仅亲鱼体内的补体活性升高,其所产卵子中的补体活性也相应升高,说明传递给后代的母源性补体具有功能活性。再者,胚胎攻毒实验表明免疫亲鱼所产后代的死亡率显著低于未免疫亲鱼所产后代的死亡率,说明母源传递因子具有免疫功能。最后,向正常斑马鱼胚胎中注射补体C3和Bf抗体后,胚胎的抗感染能力明显降低,这就从另一侧面说明补体C3和Bf参与早期胚胎免疫。本论文第三部分主要研究斑马鱼补体系统的发生与成熟。除补体因子C6外,所有目的基因在孵化前的表达量都很低,孵化后则明显升高;而补体C6（参与溶解途径）在新受精卵中的大量表达,之后其表达水平迅速降低,孵化后逐步回升。此外,参与替代途径的Bf表达水平一直高于参与经典途径的C1r/s和C4,说明在斑马鱼胚胎发育和早期胚后发育过程中替代途径比经典途径更为重要。以LPS感染胚胎/幼鱼后,参与替代途径的C3和Bf在孵化后迅速上调并超过对照组;参与经典途径和凝集素途径的C1r/s和MASP的表达水平却没有升高,甚至还有所降低;同时参与经典途径和凝集素途径的C4在胚胎发育早期呈下调趋势,之后其表达水平维持在与对照组同等水平并略有波动;参与凝集素途径的MBL的表达水平在18 dpf之前与对照组无显著差异,但此后却开始显著上调。由此我们推测斑马鱼的替代性补体系统可能从胚胎孵化后逐渐发育成熟并获得免疫活性。另外,参与溶解途径的C6基因的调控模式比较特殊,在孵化前其表达水平显著下调,孵化后不久又开始迅速上调,可能意味着LPS感染促进了卵中母源性C6 mRNA的大量消耗。从胚胎到3周大小的幼鱼,C1r/s和C4的表达水平几乎不受LPS感染的影响,说明补体经典途径可能仍在发育之中,而关于凝集素途径的发育还有待于深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 补体系统概述
• 1.1 补体学研究简史
• 1.2 补体系统的组成
• 1.3 补体系统的激活
• 1.4 补体系统的功能
• 2 鱼类补体系统研究进展
• 2.1 软骨鱼类补体系统研究进展
• 2.2 硬骨鱼类补体系统研究进展
• 2.3 鱼类补体的特异性
• 2.4 鱼类补体系统的生物学活性
• 3 鱼类的母源性免疫
• 4 本论文研究内容及意义
• 第二章 斑马鱼卵母源性补体系统的杀菌活性研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 大肠杆菌的培养及处理
• 2.3 斑马鱼卵无细胞体系的制备
• 2.4 斑马鱼卵无细胞体系中总蛋白浓度的测定
• 2.5 斑马鱼卵无细胞体系的杀菌试验
• 2.6 斑马鱼卵无细胞体系对细菌细胞损伤的电镜观察
• 2.7 斑马鱼卵无细胞体系中补体杀菌活性的检测
• 2.8 斑马鱼卵无细胞体系中补体途径的抑制试验
• 2.9 斑马鱼卵无细胞体系中补体成分的Western blot 检测
• 2.10 数据处理
• 3 结果
• 3.1 斑马鱼卵无细胞体系溶菌活性的特点
• 3.2 斑马鱼卵无细胞体系对细菌损伤的电镜观察
• 3.3 斑马鱼母源性补体的溶菌活性
• 3.4 斑马鱼母源性补体系统的溶菌机制
• 3.5 斑马鱼母源性补体成分存在于新受精卵
• 4 讨论
• 第三章 斑马鱼母源性补体因子的传递与免疫功能
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 化学试剂及仪器
• 2.2 实验动物
• 2.3 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的培养与处理
• 2.4 斑马鱼免疫与样品采集
• 2.5 总蛋白浓度测定
• 2.6 兔红细胞的采集与处理
• 2.7 替代途径补体活性（ACH50）测定
• 2.8 补体蛋白C3 和Bf 的ELISA 测定
• 2.9 胚胎攻毒实验
• 2.10 数据处理
• 3 结果
• 3.1 斑马鱼全鱼和胚胎匀浆液的总蛋白含量
• 3.2 母源免疫对斑马鱼亲鱼及其后代补体含量的影响
• 3.3 母源免疫对斑马鱼亲鱼及其后代ACH50 的影响
• 3.4 母源免疫对斑马鱼胚胎抗感染能力的影响
• 3.5 斑马鱼胚胎中补体的抗感染作用
• 4 讨论
• 第四章 斑马鱼个体发育过程中补体基因表达模式及补体系统的发育和成熟
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设计
• 2.3 斑马鱼胚胎/幼鱼总RNA 的提取
• 2.4 RNA 的消化
• 2.5 反转录
• 2.6 Real-time PCR 分析
• 2.7 数据处理
• 3 结果
• 3.1 斑马鱼胚胎总RNA 提取
• 3.2 反转录cDNA 的质量
• 3.3 引物特异性和扩增效率
• 3.4 补体基因的实时荧光定量PCR 检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介