Cystatin C真核表达载体的构建及对ox-LDL诱导的人血管平滑肌细胞凋亡的影响

论文摘要

目的胱抑素C（Cystatin C）是低分子量碱性分泌性非糖基化蛋白质，由于其相对分子量较少，能够自由通过肾小球滤过膜，又几乎全部通过近曲小管重吸收和分解代谢，因而一直以来被作为一种理想的反映肾小球滤过率的内源性标志物研究较多。近来研究发现，Cystatin C与动脉粥样硬化（AS）、动脉瘤以及经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）后再狭窄等疾病的发生发展密切相关。为进一步探讨Cystatin C基因的生物学特性、探索可能的信号通路以及为以后的基因干预和治疗奠定基础，克隆Cystatin C基因并构建Cystatin C表达载体以及获得活性Cystatin C蛋白是非常重要的。血管平滑肌细胞（VSMC）在AS、动脉瘤、PTCA术后再狭窄等疾病发生发展过程中起着举足轻重的作用，VSMC凋亡是调节血管壁细胞数量的重要生理方式。研究影响VSMC凋亡的因素，抑制VSMC的凋亡，寻找新的干预靶点，对增加AS晚期斑块的稳定性、阻止和延缓动脉瘤的发生发展以及调节再狭窄过程中血管重塑具有重要意义。Cystatin C作为既存在于细胞内又存在于细胞间的重要蛋白酶，对VSMC活性的调节作用值得进一步研究。因此，体外培养人VSMC，模拟VSMC所处的高脂环境，构建ox—LDL诱导的VSMC凋亡模型，将Cystatin C转染VSMC，并检测Cystatin C对VSMC凋亡指标的影响，对进一步研究Cystatin C在心血管疾病中发挥的特殊作用具有深远的意义，并为以后的动物实验打下良好的基础。方法1人脐静脉内皮细胞系（HUV-EC-C）的培养2人VSMC的培养与鉴定实验取材于水囊引产胎儿主动脉段,进行原代及传代细胞培养。α-actin免疫组化染色法行细胞鉴定,倒置相差显微镜照相。3总RNA的提取及RT-PCR按TRIzol试剂盒说明白HUV-EC-C提取总RIgA,应用PCR引物RT-PCR获得含BamH I和Xba I双酶切位点的Cystatin C全基因序列。4 Cystatin C真核表达质粒pCDNA3.1-Cystatin C的构建胶回收试剂盒回收所需的Cystatin C全基因序列,连接至pMD-18-simple T载体上,热激转化入感受态大肠杆菌中,质粒小量提取试剂盒提取重组质粒,酶切质粒,胶回收所需的Cystatin C全基因序列备用;将pCDNA3.1表达载体热激转化入感受态大肠杆菌,利用BamH I和Xba I双酶切,胶回收所需的载体片段;将Cystatin C全基因序列和载体片段利用T4连接酶连接,热激转化入感受态大肠杆菌培养后,提取质粒,利用PCR及BamH I和Xba I双酶切鉴定获得阳性克隆,大量抽提试剂盒获取转染用的质粒。5构建表达Cystatin C的人VSMC细胞模型脂质体法瞬时转染人VSMC,分别培养细胞12h、24h和48h,利用RT-PCR及Western blot法检测构建的细胞中Cystatin C的表达。6诱导模型构建利用ox-LDL诱导人VSMC,MTT法检测ox-LDL诱导时间及浓度对细胞存活率的影响,确定ox-LDL最佳诱导浓度（40mg/L）和时间（24h）,将对数生长期的人VSMC随机分成正常细胞组、转染组即pCDNA3.1-Cystatin C转染、ox-LDL诱导组以及诱导+转染组即ox-LDL诱导+DCDNA3.1-Cystatin C转染。7检测各组细胞凋亡相关指标检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）、三磷酸腺苷（ATP）生成量以及Caspase-3活性变化,并通过RT-PeR和Western-blot法测定各组凋亡相关基因Bax及Bcl-2的表达情况。结果1成功体外培养人VSMC。2成功克隆人Cystatin C基因及构建其真核表达载体,转染VSMC后稳定表达。3转染组对于LDH、ROS、ATP、Caspase-3、Bax、Bcl-2的影响与正常细胞组比较差异无统计学意义。诱导+转染组与ox-LDL诱导组比较,LDH、ROS生成量和Caspase-3活性明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;ATP生成量显著升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。RT-PCR和Western-blot法测定,在ox-LDL诱导组促凋亡基因Bax表达增加、抗凋亡基因Bcl-2表达减少,在诱导+转染组Bcl-2表达增加、Bax表达减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1应用PCR和T-A克隆技术,成功获得人Cystatin C全基因序列的克隆,并成功构建重组质粒pCDNA3.1-Cystatin C,获得了Cystatin C基因在人VSMC中的稳定表达。2 Cystatin C可通过改善细胞膜稳定性和线粒体功能以及上调抑凋亡基因Bcl-2和下调促凋亡基因Bax,从而在一定程度上抑制ox-LDL诱导的人VSMC凋亡。创新点与限制性1创新点:以往对于胱抑素C（Cystatin C）的研究主要集中在对其血清浓度水平与机体疾病的关系上,本研究着重于对其分子基因水平的研究,克隆人Cystatin C基因全序列,构建真核表达载体,将其转染人血管平滑肌细胞（VSMC）,并检测了Cystatin C对ox-LDL诱导的VSMC凋亡的影响,初步探讨了可能的影响机制,对于进一步研究Cystatin C在动脉粥样硬化中的作用机制并将其利用于可能的基因治疗方面有一定的帮助,并为下一步进行的基因干预打下了良好的基础。2限制性:因时间和资金有限,本实验未能研究Cystatin C对ox-LDL诱导的VSMC凋亡的具体细胞信号转导通路的影响;与其他细胞外蛋白酶之间的相互影响作用有待于进一步研究。

论文目录

• 1 论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 创新点与限制性
• 附表及附图
• 附图
• 附表
• 参考文献
• 2 致谢
• 3 攻读硕士学位期间撰写及发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表