新型筛选标记的烟草叶绿体转化载体构建

论文摘要

叶绿体基因组转化的筛选标记多为抗生素抗性基因,它们虽然高效,但存在不少缺点。四吡咯分子如血红素、叶绿素和西罗血红素是植物重要的功能分子,其合成一些关键酶的编码基因,如编码谷氨酸半醛转氨酶的基因作为植物转基因的安全标记,根据转基因后代的白化性状,进行高效筛选,而尿卟啉原甲基化酶是一种新型红色荧光蛋白,但是,在植物中的应用还没有报道。目前,烟草质体转化的技术最为成熟,本研究主要构建烟草叶绿体转化载体,将大肠杆菌编码谷氨酸半醛转氨酶的基因hemL作为筛选标记,玉米编码尿卟啉原甲基化酶的基因cobA作为荧光报告基因,利用同源重组片段trnI/trnA构建烟草叶绿体遗传转化的表达载体。本实验结果如下:1.采用改进的高盐低pH法提取烟草叶绿体基因组DNA,基因组大小为23kb,OD260:OD280值均在1.8～2.0范围内,提取的叶绿体基因组质量很高。2.根据NCBI公布的烟草同源重组蛋白trnI/trnA、质体核搪体（16S）RNA操纵元启动子Prrn和质体psbA基因3’端psbA3序列,以烟草叶绿体基因组为模板,PCR扩增出trnI/trnA、Prrn、psbA3’的特异DNA片段,扩增片段测序结果:trnI基因长度为969 bp,trnA基因长度为883 bp,Prrn基因长度为144 bp,psbA3’基因长度为508 bp,与烟草叶绿体基因组公布的序列进行对比分析,同源性较高。3.根据公布的hemL和cobA序列,分别以大肠杆菌谷氨酸半醛转氨酶基因GSAT的重组质粒和玉米尿卟啉原甲基化酶SUMT的重组质粒为模板,PCR扩增出hemL和cobA特异片段。扩增片段测序结果:hemL基因长度为128 8bp,cobA基因长度为846 bp。与公布的序列进行对比分析,同源性为100%。4.分别用相应的限制性内切酶消化相应的重组质粒,回收外源片段,根据pBluescriptSK+多克隆位点和顺序,按差异性位点将外源片断依次插入到pBluescript SK+中,构建了烟草新型叶绿体表达载体pBSK-TPTCPhemL,序列为:trnI→Prrn→RBS→hemL→RBS→cobA→psbA3’→trnA。用HindⅢ酶切pBSK-TPTCPhemL载体,琼脂糖凝胶电泳检测大小为7000 bp左右,说明构建的载体大小正确。综上所述,本文成功克隆了编码烟草叶绿体表达载体的基因片段,并构建了烟草表达载体,为进一步研究这两个基因作为叶绿体转化的筛选基因和标记基因、建立安全高效的叶绿体转化体系和生物反应器技术奠定基础,在作物遗传育种改良方面具有广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 高等植物叶绿体转化
• 1.2 植物核基因组和叶绿体基因组转化的非抗生素筛选
• 1.3 叶绿体转化载体的构建策略
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 设备、仪器和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟草的培育
• 2.2.2 烟草叶绿体基因组DNA提取
• 2.2.3 trnI/trnA、Prrn、psbA3'、hemL和cobA的克隆
• 2.2.4 烟草叶绿体转化载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 烟草叶绿体基因组的提取
• 3.2 烟草叶绿体基因组trnI/trnA、Prrn、psbA3'片段的扩增
• 3.3 hemL和cobA片段的扩增
• 3.4 扩增片段测序
• 3.5 载体构建
• 4 讨论
• 4.1 叶绿体基因组的提取
• 4.2 烟草叶绿体基因组DNA特异片段的扩增
• 4.3 叶绿体转化载体的构建
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介