论文摘要
老年痴呆（Alzheimer’s disease,AD）是老年人中最普遍的一种中枢神经系统退行性疾病。该疾病以脑内聚集的淀粉样蛋白（Amyloid beta）水平显著升高和神经纤维纠结（Neurofibrillarry tangles）为主要特征的,早老素基因（Presenilin,PS）在AD病理学中起重要作用,揭示其生理功能对阐明AD的具体分子机制具有重要意义。早老素是跨膜的天冬氨酸蛋白酶,有PS1和PS2两种形式,基因敲除研究表明,在前脑条件性PSl和PS2双敲除（PS conditional knock out,cDKO）小鼠表现出类似AD的进行性的神经退行性病理变化,包括认知能力衰退和前脑退化等,但是这些病理症状不依赖于脑内Aβ水平的升高,其确切的分子机理还未阐明。限制热量摄入（Calorie restriction）是通过再保持营养正常的情况下,降低饲料中的碳水化合物的含量,从而减少动物总热量的摄入。CR已被证实能够延长多种模式动物的寿命,并且还能够改善多种神经退行性疾病动物模型的病征。为了考察CR是否能改善cDKO小鼠的多种神经退行性表型,本实验对4月龄的cDKO小鼠进行4个月的热量摄入的限制,然后进行行为学和组织学检测,以考察CR对cDKO小鼠神经退行性疾病表型的影响。接着运用高密度基因芯片技术、荧光实时定量PCR技术以及Western blot等分子生物学技术进一步考察CR引起的分子水平的表型变化,从而初步探讨CR对cDKO小鼠的生理效果的分子机理,同时为开发AD的治疗方案提供一些理论基础。1.限制热量摄入改善cDKO小鼠神经退行性疾病的表型对cDKO小鼠进行4个月的热量摄入限制后,用开放场实验、新物体识别和情境式恐惧性条件反射检测限制热量摄入（CR）,无限制热量摄入（AL）以及野生型小鼠（WT）的cDKO小鼠的运动能力和海马依赖的学习记忆能力。结果表明,CR能够将二叉分布的非正常的cDKO小鼠的运动能力正常化,并且CR对海马依赖的记忆有明显的改善作用。接着我们用HE染色以显示WT、AL和CR的8月龄小鼠的脑部形态,并进行比较。WT与AL比较的结果表明,如原来报道的一致,前脑敲除早老素能够导致前脑显著的萎缩,包括皮层厚度降低,海马萎缩,侧脑室增大。AL与CR的比较结果表明,限制热量摄入能够明显的减缓前脑的萎缩,包括CR小鼠的海马增大,侧脑室缩小。综合行为学和形态学结果,CR能够显著的减轻cDKO小鼠的非空间记忆能力缺陷和前脑萎缩,表现出部分改善神经退行性症状的作用。2.限制热量摄入部分改善cDKO小鼠神经退行性症状的可能分子机理为探讨CR的生理效果的可能分子机理,运用分子生物学技术考察了CR对皮层和海马在分子水平上的影响。首先采用Western Blot技术检测各种老年痴呆神经病例学的分子标记。星型角质细胞的标记GFAP在老年痴呆病人和cDKO小鼠中的蛋白水平都有上调,然而在CR组小鼠中,GFAP的蛋白水平明显下降。与此同时,用基因芯片的方法发现许多与炎症反应相关的基因在CR组小鼠的海马中均有下调。这些证据表明炎症反应的降低很有可能是CR改善cDKO小鼠神经退行性表型的原因之一。用磷酸化Tau蛋白的特异性抗体检测WT,AL和CR三组小鼠皮层Tau蛋白的磷酸化水平发现,CR能够显著的降低cDKO小鼠皮层组织中高度磷酸化的Tau蛋白。与此同时,CR降低了cDKO小鼠皮层中p25蛋白的含量。p25能够高度激活Cdk5激酶,从而导致Tau蛋白的高度磷酸化。因此,CR降低小鼠高度磷酸化Tau蛋白很有可能是通过降低Cdk5激酶活力来实现的。用western blot技术还发现CR能够明显降低cDKO小鼠皮层中激活的caspae-3含量。激活Caspase-3的细胞发生凋亡的一个重要指标,因此CR很有可能是通过降低神经元的凋亡从而延缓大脑萎缩的。此外,用基因芯片的方法还发现许多与新神经元生成有关基因的表达水平在CR组海马中有显著的上调。CR对cDKO小鼠神经退行性病理变化的改善作用在皮层和海马中可能是通过不同的途径实现的。尽管本研究并未彻底阐明CR改善认知能力和减轻神经退行性病理症状的具体分子机制,但为进一步的研究和开发治疗神经退行性痴呆的方案提供了理论依据。
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