论文摘要
人巨细胞病毒含有约2025种蛋白质,其中在介导HCMV感染和病毒复制中有3种蛋白作用最为重要,即由ORFUL82编码的磷蛋白pp71、ORFUL83编码的pp65和ORFUL69编码的PUL69。上述3种蛋白共同的特点是启动HCMV对宿主细胞的感染和病毒的复制,同时在逃逸T淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明,在这3种间层蛋白中以ORFUL82编码的蛋白pp71的作用最为显著,该pp71蛋白单独存在时,是一种较强的抗原蛋白,可刺激机体产生抗体,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV感染后pp71蛋白的产生可以明显增强细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达,从而引起移植物血管病变和排斥反应[1]。在视网膜母细胞瘤,pp71蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白P105、P107、P130等的衰变[2,3]。pp71蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周期并使它们停止在G1晚期,而这段时期对病毒复制最为有利,所以它能够增加病毒繁殖,加快病毒在细胞间传递,体外将HCMV转染人纤维细胞后,病毒DNA复制效率在共转染ORFUL82条件下,感染及复制效率增加了80倍[4-9]。研究证实pp71不仅对HCMV的IE1和IE2基因表达有促进作用,而且对晚期基因的表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用[10]。因此,Baldick指出,ORFUL82（pp71蛋白）可作为抗HCMV病毒药物设计的有效靶点[11,12]。为进一步研究pp71蛋白基因在真核细胞-人包皮成纤维细胞（HFF）中的表达,并制备抗pp71单克隆抗体,为临床研制新型抗HCMV药奠定坚实基础,本研究进行了以下工作:1.人包皮成纤维细胞的培养取已冻存的第3代HFF细胞,在含10%小牛血清（FBS）的DMEM完全培养基中培养,待细胞生长接近铺满培养瓶壁时,按1:3分瓶培养,并标记传代时间,代数及细胞名称,于37℃、5%CO2孵箱中继续培养。将传至对数生长期的第14代HFF细胞封管冻存,以备后用。2.基因重组质粒pSG5-pp71的鉴定（1）利用氯化钙法将重组质粒pSG5-pp71转入DH5α大肠杆菌内。（2）提取重组质粒pSG5-pp71,以BamHI、EcoRI单酶和双酶切方法初步鉴定阳性克隆基因;设计引物,用PCR方法扩增目的基因片段进一步鉴定重组质粒,然后测序。对pp71基因DNA片段的测序结果,与基因库中的标准序列比较,同源性为100%,说明重组质粒已成功构建。3.基因重组质粒pSG5-pp71在HFF细胞中的表达与纯化鉴定（1）基因重组质粒pSG5-pp71在人包皮纤维细胞中稳定转染。（2）以抽提的HFF细胞总RNA为模板,合成的两对引物为扩增对象,行RT-PCR检测重组质粒表达是否成功。（3）表达产物的Western blot鉴定稳定转染pSG5-pp71的人包皮成纤维细胞裂解物依次经Ni-NTA亲和层析纯化及SDS-PAGE蛋白电泳后,Western blot检测发现在Mr为71 000左右处有一条针对pp71抗体的特异性条带,与理论分子量一致。4.将纯化后的pp71蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,制备抗pp71的单克隆抗体（Mab）,得到3株均为IgG1 Kappa型Mab（2D10,1C3和1A6）。将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型抗人的pp71 Mab。酶联免疫吸附试验（ELISA）证明腹水效价可达为1:105～1:106;Mab亲和力实验结果表明,三株单克隆抗体的亲和力依次为2D10>1A6>1C3;Western blot结果鉴定提示该Mab可以特异性的结合pp71,其分子量约为71×103kD。综上所述,我们应用细胞培养技术及基因工程技术及方法,获得了具有特异性抗原性的pp71蛋白,制备了其单克隆抗体。这为我们进一步探讨HCMV UL82基因在免疫自稳调节中的地位、精确的识别抑制性受体在细胞内的靶点及其它生物学功能奠定了坚实的基础;同时,为下一步获取大规模抗pp71单克隆抗体,为临床研制新型抗HCMV药物开拓了思路。
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