导读:本文包含了乳腺特异性表达载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:启动子,PolyA序列,促乳素,绿色荧光蛋白
乳腺特异性表达载体论文文献综述
罗婵,任艳萍,屈春凤,李海洋,李湘萍[1]（2015）在《启动子和PolyA序列对水牛乳腺特异性表达载体表达效率的影响》一文中研究指出为了获得能有效表达促乳素的乳腺特异性表达载体,本研究系统比较了不同长度的启动子和有/无PolyA序列对乳腺特异性表达载体表达标记基因绿色荧光蛋白(GFP)和目的基因促乳素(PRL)的影响。将不同载体瞬时转染Bcap37细胞后,分别用实时定量PCR和流式细胞仪检测PRL和GFP的表达水平。结果表明:长度为5.2 kb的β-酪蛋白(Beta casein,BCN)启动子启动PRL的表达量显着高于长度为3.8 kb启动子,前者的表达量约为后者的6倍;在BCN启动子长度均为5.2 kb情况下,添加PolyA的载体p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP-Neo组PRL的相对表达量为8.17,p5.2BCN-PRL-PolyA-CMV-GFP组PRL的相对表达量为17.84,均显着高于p5.2BCNPRL-CMV-GFP-Neo组,可见添加PolyA后,PRL的表达量均显着增加;进一步比较发现,含PolyA的载体中GFP的表达水平也显着高于不含PolyA的载体。对比以上结果发现,添加PolyA能够有效解除启动子之间的转录干扰,使标记基因的启动子CMV和目的基因的启动子BCN均能顺利启动基因表达。经过优化的载体启动目的基因PRL表达的效率更高,可应用于下一步的研究工作中。(本文来源于《中国畜牧杂志》期刊2015年09期）
张曼[2]（2015）在《奶山羊BLG基因调控序列指导的乳腺特异性表达载体的构建和优化》一文中研究指出乳腺生物反应器是用乳蛋白基因启动子和调控区指导外源基因在动物乳腺中定位表达。乳腺生物反应器的应用价值与外源基因表达水平的高低相关。乳腺生物反应器制备的关键是乳腺特异性表达载体的构建,而启动子的选择是乳腺表达载体构建的核心。为了使外源基因在转基因动物乳腺中能够高效特异地表达,本实验以西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因为研究对象,扩增了山羊的5ˊ侧翼区,内含子1、内含子2和3ˊ端调控区域序列,构建了真核表达载体,初步探讨了该启动子的活性和表达特异性。结果如下:(1)利用高保真PCR方法克隆了奶山羊β-乳球蛋白基因启动子(2.1 kb,包括5'侧翼区和部分第一外显子),3'端调控成分(最后一个不翻译外显子,内含子和3'侧翼区)及第一内含子和第二内含子。测序分析表明,与其他反刍动物相比较,奶山羊BLG基因5'端调控序列保守性优于3'端调控成分。(2)为了筛选出启动效率高的启动子片段,在下游引物相同的条件下,以克隆的β-乳球蛋白基因2.1 kb启动子为模板,进行删减分析。分别扩增了2081 bp(﹣2041/+40),1981 bp(﹣1941/+40),1881 bp(﹣1841/+40),1681 bp(﹣1641/+40),1481 bp(﹣1441/+40),1281 bp(﹣1241/+40),1081 bp(﹣1041/+40),881 bp(﹣841/+40),681 bp(﹣641/+40),481 bp(﹣441/+40),431 bp(﹣391/+40),381 bp(﹣341/+40)和331 bp(﹣291/+40)共13个片段,将其分别插入质粒PGL4.10的多克隆位点,并分别转染HC11、293T和山羊胎儿成纤维细胞,通过双荧光素酶报告基因检测发现,山羊BLG基因的启动子具有组织特异性,片段大小为431 bp(﹣391/+40)时启动子活性最高。(3)为了探究内含子在基因表达中的作用,我们以pEGFP-C1为骨架载体,通过AseⅠ和NheⅠ双酶切,用431 bp(﹣391/+40)启动子替换pEGFP-C1的启动子CMV,以克隆的内含子1、内含子2和3ˊUTR为调控元件构建载体pE-BLGU11,pE-BLGIN1U11和pE-BLGINU。通过qRT-PCR和Western blot,在mRNA和蛋白质表达水平上检测内含子在基因表达中的作用。结果显示BLG基因的内含子具有增强基因表达的作用,且第一内含子的作用比第二内含子作用更为明显。本实验通过PCR克隆并分析了奶山羊β-乳球蛋白基因的启动子序列,通过梯度删减筛选出启动效率最高的启动子区域;以pEGFP-C1为骨架,证明了β-乳球蛋白基因的内含子具有增强子的作用。利用克隆的调控元件构建了山羊乳腺特异性表达载体,为提高外源基因在乳腺组织中的表达及乳腺生物反应器的制备奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
杜威,刘羿羿,王申元,张东,白宏伟[3]（2013）在《嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体鉴定》一文中研究指出本研究目的在于对实验室优化构建的嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体PLOX-LacS的功能进行鉴定,检测目的基因能否正常表达。实验通过脂质体介导方法将载体质粒转染小鼠的乳腺癌细胞,筛选获得的阳性细胞通过PCR和RT-PCR的方法进行嗜热菌β-糖苷酶基因的整合检测和表达检测。基因整合PCR鉴定结果表明小鼠乳腺癌细胞基因组中整合有嗜热菌糖苷酶基因,目的片段大小为1203bp;RT-PCR表达鉴定结果显示,目的片段大小与预期相同,说明诱导后的小鼠乳腺癌细胞表达了完整的嗜热菌β-糖苷酶基因。实验表明该载体能够使目的基因整合在乳腺细胞基因组中并特异性表达。为后期生产转基因奶牛提供实验材料。(本文来源于《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》期刊2013年05期）
郜富权,樊宝良[4]（2013）在《牛磺酸合成限速酶基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建》一文中研究指出为了构建提高牛奶中牛磺酸含量的乳腺特异性表达载体,试验采用RT-PCR方法从牛的乳腺组织中扩增出牛磺酸合成限速酶——半胱亚磺酸脱羧酶(CSAD)cDNA,克隆至pMD-19T载体,测序正确后通过XhoⅠ酶切连接到乳腺特异性表达载体pBLG上,再进行测序比对及酶切鉴定。结果表明:所构建的载体与预期完全相符。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2013年17期）
杜威[5]（2013）在《嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体的构建、转染及鉴定》一文中研究指出利用牛乳腺生物反应器产生乳糖分解酶从而生产低乳糖牛奶，是解决乳糖不耐症的一种手段，而构建高效、特异的表达载体是制备乳腺生物反应器的关键步骤。本实验将来源于古细菌的嗜热菌β-糖苷酶基因（LacS）根据牛的密码子使用频率进行了密码子优化，并合成了优化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游调控区域做为启动子，以嗜热菌β-糖苷酶（LacS）为目的基因，添加了Loxp锚定的新霉素抗性基因（Neo）和增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)，构建了pLOX-EGFP-BLG-LacS载体。并且通过脂质体介导方法将重组质粒转染小鼠的乳腺癌细胞，并筛选得到单克隆。阳性单克隆通过PCR进行DNA水平的整合检测；经催乳素诱导后的阳性单克隆通过RT-PCR进行mRNA水平表达检测。研究结果如下：首先,乳腺特异表达载体的构建。通过PCR技术扩增出924bp牛β-乳球蛋白（BLG）基因5′调控序列，并与T载体连接记为pMD-19BLG，质粒大小为3.7kb。然后将其与公司优化合成的pUC57-LacS质粒，pLOX-EGFP质粒通过相应的酶切后进行连接，经基因重组后构建了乳腺特异性表达载体pLOX-EGFP-BLG-LacS。使牛β-乳球蛋白基因5′端调控序列启动嗜热菌糖苷酶基因在乳腺中特异表达，而新霉素抗性基因和EGFP的表达，便于筛选阳性克隆。其次，乳腺特异性表达载体转染小鼠乳腺癌细胞。37℃水浴解冻小鼠乳腺癌细胞，并进行G418最小致死浓度测定,然后通过脂质体介导重构载体转染小鼠乳腺癌细胞，并通过PCR和RT-PCR的方法进行重构载体的整合检测和表达检测。结果表明，小鼠乳腺癌细胞G418最小致死浓度为700μg/mL, DNA水平整合检测结果表明小鼠乳腺癌细胞基因组中整合有嗜热菌糖苷酶基因，目的片段大小为1203bp；RT-PCR表达鉴定结果显示，目的片段大小与预期相同，说明BLG启动子能正确启动经密码子优化后的LacS基因在乳腺细胞中的表达。综上所述，该表达载体能够在乳腺中特异性表达，可以为核移植提供细胞来源，进行后续实验。(本文来源于《内蒙古农业大学》期刊2013-06-01）
曹随忠,姚学萍,崔亚飞,杨德英,雍康[6]（2013）在《奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定》一文中研究指出【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显着提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。(本文来源于《西北农林科技大学学报(自然科学版)》期刊2013年06期）
符梅[7]（2013）在《牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建》一文中研究指出本研究以牦牛β-防御素5基因为研究对象，分别对牦牛β-防御素5基因进行原核和真核表达研究。原核表达以pET-32a(+)为表达载体，将构建好的重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，检测其重组蛋白的体外抑菌活性。真核表达以奶牛β-酪蛋白基因（β-casein，CSN2）5'端和3'端为调控成分，牦牛β-防御素5基因CDS区为表达序列，构建牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体，将表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞，分析牦牛β-防御素5基因的表达效率。具体如下：1.采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增牦牛BNBD5基因成熟肽编码区及BNBD5基因开放阅读框。PCR产物经胶回收纯化后，克隆于pMD19-T载体的T位点。测序结果表明，获得了138bp的BNBD5成熟肽编码片段及219bp的开放阅读框，成熟肽编码45个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现，该基因的序列与牛的mRNA同源性最高，可达到86.2%。2.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，于37°C06h间进行诱导表达，SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况，并对该重组蛋白进行纯化测定其体外抗菌活性。结果表明，经IPTG诱导，获得了分子量约为25kDa的牦牛β-防御素5基因成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散法表明，0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抗菌作用。3.利用普通PCR法扩增了奶牛CSN25'端1947bp（包括1.7kb的上游调控序列以及5'不翻译区的第一个外显子）、3'端620bp（包括最后一个内含子、最后一个不翻译的外显子和150bp的侧翼）调控区及牦牛β-防御素5基因的开放阅读框，并利用双酶切定向克隆的方法，将他们克隆于pEGFP-C1真核表达载体上，构建了牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体。4.采用脂质体转染的方法将构建的牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞中，经新霉素抗性基因（G418）初步筛选后，借助荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达。通过设计一对特异性引物，对初步筛选的阳性克隆进行检测，结果表明，表达载体已整合到乳腺上皮细胞的染色体中，证明了构建的乳腺特异性表达载体的可行性。(本文来源于《西南民族大学》期刊2013-04-01）
陈建文,刘星,范彩云,李运生,包文斌[8]（2013）在《猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建》一文中研究指出为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。(本文来源于《扬州大学学报(农业与生命科学版)》期刊2013年01期）
任春环,曹鸿国,程箫,冯颖,张子军[9]（2012）在《山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建及核供体细胞的转染》一文中研究指出为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。(本文来源于《安徽农业大学学报》期刊2012年05期）
林建,庾庆华,张强,杨倩[10]（2012）在《乳腺特异性表达载体PIN的构建及其表达效率的研究》一文中研究指出山羊奶单产量低是制约我国们羊奶产业发展的瓶颈,培育高产转基因奶山羊品系,显着提高奶产量是解决该问题的有效方法。体内影响乳腺发育的激素主要为生长激素、催乳素、孕酮、雌激素和类胰岛素生长因子(IGF-1)。其中IGF-1在泌乳期主要通过调节营养分配和维持乳腺细胞活力来提高奶产量。本研究通过构建乳腺特异性表达载体PIN,研究IGF-1基因在体外人乳腺癌细胞Bcap-37和体内山羊乳腺中的表达水平,旨在为进一步生产转IGF-1基因奶山羊提供试验材料。本研究以萨能奶山羊为材料,首先采用RT-PCR从萨能奶山羊的肝脏组织中扩增IGF-1片段;同时以质粒pCDNA3.1为模板,PCR扩增真核筛选标记新霉素(neo)基因。然后选用pBC1为骨架载体,构建乳腺特异性表达载体载体PIN。采用脂质体法将乳腺特异性表达载体PIN转入到人乳腺癌细胞系Bcap-37,在转染后12、24、36和48小时收集细胞培养上清并提取细胞总蛋白,采用放免方法检测样品中的IGF-1含量。同时采用直接灌注400ng质粒PIN进入泌乳期山羊乳腺,然后采集乳腺组织样,并对其进行IGF-1含量检测验证载体体外表达效率。结果表明成功扩增出483bp的IGF-1基因和1505bp的neo基因,酶切验证,并进一步通过测序比对显示与NCBI上登录的IGF-1序列(GenBank ID:D11378)100%同源。Bcap-37细胞水平上荧光定量PCR结果显示转染PIN组IGF-1 mRNA表达水平显着高于(3000倍)对照组和空白组;RIA结果显示IGF-1含量在第36小时显着高于对照组和空白组(P<0.05)。在山羊乳腺上进行的质粒灌注实验结果显示:在灌注质粒的一侧,灌注质粒组IGF-1含量(0.98±0.11 ng/mg)显着高于对照组(0.72±0.03 ng/mg)。(结论)本研究成功构建乳腺特异性表达载体PIN,在Bcap-37细胞和泌乳期山羊乳腺中的蛋白表达水平均显着高于对照组。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十七次学术研讨会论文集（下）》期刊2012-07-10）
乳腺特异性表达载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乳腺生物反应器是用乳蛋白基因启动子和调控区指导外源基因在动物乳腺中定位表达。乳腺生物反应器的应用价值与外源基因表达水平的高低相关。乳腺生物反应器制备的关键是乳腺特异性表达载体的构建,而启动子的选择是乳腺表达载体构建的核心。为了使外源基因在转基因动物乳腺中能够高效特异地表达,本实验以西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因为研究对象,扩增了山羊的5ˊ侧翼区,内含子1、内含子2和3ˊ端调控区域序列,构建了真核表达载体,初步探讨了该启动子的活性和表达特异性。结果如下:(1)利用高保真PCR方法克隆了奶山羊β-乳球蛋白基因启动子(2.1 kb,包括5'侧翼区和部分第一外显子),3'端调控成分(最后一个不翻译外显子,内含子和3'侧翼区)及第一内含子和第二内含子。测序分析表明,与其他反刍动物相比较,奶山羊BLG基因5'端调控序列保守性优于3'端调控成分。(2)为了筛选出启动效率高的启动子片段,在下游引物相同的条件下,以克隆的β-乳球蛋白基因2.1 kb启动子为模板,进行删减分析。分别扩增了2081 bp(﹣2041/+40),1981 bp(﹣1941/+40),1881 bp(﹣1841/+40),1681 bp(﹣1641/+40),1481 bp(﹣1441/+40),1281 bp(﹣1241/+40),1081 bp(﹣1041/+40),881 bp(﹣841/+40),681 bp(﹣641/+40),481 bp(﹣441/+40),431 bp(﹣391/+40),381 bp(﹣341/+40)和331 bp(﹣291/+40)共13个片段,将其分别插入质粒PGL4.10的多克隆位点,并分别转染HC11、293T和山羊胎儿成纤维细胞,通过双荧光素酶报告基因检测发现,山羊BLG基因的启动子具有组织特异性,片段大小为431 bp(﹣391/+40)时启动子活性最高。(3)为了探究内含子在基因表达中的作用,我们以pEGFP-C1为骨架载体,通过AseⅠ和NheⅠ双酶切,用431 bp(﹣391/+40)启动子替换pEGFP-C1的启动子CMV,以克隆的内含子1、内含子2和3ˊUTR为调控元件构建载体pE-BLGU11,pE-BLGIN1U11和pE-BLGINU。通过qRT-PCR和Western blot,在mRNA和蛋白质表达水平上检测内含子在基因表达中的作用。结果显示BLG基因的内含子具有增强基因表达的作用,且第一内含子的作用比第二内含子作用更为明显。本实验通过PCR克隆并分析了奶山羊β-乳球蛋白基因的启动子序列,通过梯度删减筛选出启动效率最高的启动子区域;以pEGFP-C1为骨架,证明了β-乳球蛋白基因的内含子具有增强子的作用。利用克隆的调控元件构建了山羊乳腺特异性表达载体,为提高外源基因在乳腺组织中的表达及乳腺生物反应器的制备奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
乳腺特异性表达载体论文参考文献
[1].罗婵,任艳萍,屈春凤,李海洋,李湘萍.启动子和PolyA序列对水牛乳腺特异性表达载体表达效率的影响[J].中国畜牧杂志.2015
[2].张曼.奶山羊BLG基因调控序列指导的乳腺特异性表达载体的构建和优化[D].西北农林科技大学.2015
[3].杜威,刘羿羿,王申元,张东,白宏伟.嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体鉴定[J].内蒙古农业大学学报(自然科学版).2013
[4].郜富权,樊宝良.牛磺酸合成限速酶基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建[J].黑龙江畜牧兽医.2013
[5].杜威.嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体的构建、转染及鉴定[D].内蒙古农业大学.2013
[6].曹随忠,姚学萍,崔亚飞,杨德英,雍康.奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版).2013
[7].符梅.牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建[D].西南民族大学.2013
[8].陈建文,刘星,范彩云,李运生,包文斌.猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建[J].扬州大学学报(农业与生命科学版).2013
[9].任春环,曹鸿国,程箫,冯颖,张子军.山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建及核供体细胞的转染[J].安徽农业大学学报.2012
[10].林建,庾庆华,张强,杨倩.乳腺特异性表达载体PIN的构建及其表达效率的研究[C].中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十七次学术研讨会论文集（下）.2012